构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体

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1、www.CRTER.org张海，等.构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体张海，蒋正方，刘阳，张波，吴贵强，曾令勇(绵阳市第三人民医院神经外科，四川省绵阳市621000)文章亮点：实验创新性采用大肠杆菌同源重组法构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体，并对其进行鉴定，发现该基因慢病毒载体的构建是方便可行的，包装体系也是成熟的，可为后续把肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体转导进神经干细胞进行基因治疗奠定基础。关键词：组织构建；组织工程；肿瘤坏死因子；相关凋亡诱导配

2、体基因；慢病毒载体；重组质粒；PCR；Westernblot主题词：TNF相关凋亡诱导配体；基因；质粒；聚合酶链反应；印迹法，蛋白质摘要背景：腺病毒的表达时间有限，会限制目的基因的表达时间和表达量，不利于实验的持续进行，故文章选择慢病毒作为载体，与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列(NM145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-A

3、geⅠ-R，用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因，AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中，产生目的重组质粒，用脂质体Lipofeetamine2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，3个质粒共同转染293T细胞，产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒，收集病毒进行滴度鉴定，收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，全长861bp，与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-m

4、Trail在转染2d后收集病毒液，经PCR和Westernblot方法鉴定，从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。张海，蒋正方，刘阳，张波，吴贵强，曾令勇.构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体[J].中国组织工程研究，2014，18(2):265-270.Constructionofalentivirusvectorfo

5、rTrailgeneinratsZhangHai,JiangZheng-fang,LiuYang,ZhangBo,WuGui-qiang,ZengLing-yong(DepartmentofNeurosurgery,theThirdHospitalofMianyang,Mianyang621000,SichuanProvince,China)张海，男，1977年生，四川省南充市人，汉族，2012年泸州医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事胶质瘤及功能神经外科研究。通讯作者：蒋正方，硕士生导师，主任医师，绵阳市第三人民医院神经外科，

6、四川省绵阳市621000doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.02.017[http://www.crter.org]中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2014)02-00265-06稿件接受：2013-11-18ZhangHai,Master,Attendingphysician,DepartmentofNeurosurgery,theThirdHospitalofMianyang,Mianyang621000,SichuanProvince,ChinaCorresp

7、ondingauthor:JiangZheng-fang,Master’ssupervisor,Chiefphysician,DepartmentofNeurosurgery,theThirdHospitalofMianyang,Mianyang621000,SichuanProvince,ChinaAccepted:2013-11-18AbstractBACKGROUND:Adenovirus,expressingwithinalimitedperiod,canlimittheexpressiontimeandamountof

8、targetgenesthatisnotconducivetoongoingexperiments.Here,weselectadenovirusasvectorsforgeneticrecombinationwithtumornecrosisfactor(TN