高免疫原性胶质瘤细胞疫苗体外抗瘤时靶细胞超微结构变化

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1、高免疫原性胶质瘤细胞疫苗体外抗瘤时靶细胞超微结构变化作者：郑树法,康德智,林元相,连葆强【摘要】目的观察高免疫原性人多形性胶质母细胞瘤（GBM）U251细胞疫苗体外诱发产生效应细胞杀伤靶细胞的超微结构变化。方法以500U/mL干扰素γ(IFNγ)诱导48h+热43℃休克2h诱导膜型热休克蛋白70(HSP70)及主要组织相容性抗原复合体I类分子（MHCI）双高表达，经丝裂霉素(MMC)灭活制成高免疫原性细胞疫苗。体外刺激健康捐献者外周血单个核细胞（PBMCs）作为效应细胞（MHCHSPCTL），进行肿瘤特异性杀伤试验；MTT比色

2、法检测其杀伤活性；透射电镜观察靶细胞受攻击后情况。结果MHCHSPCTL对野生型U251细胞特异性的杀瘤活性明显高于HSP70分子单高表达的细胞疫苗刺激组（HSPCTL）、MHCI类分子单高表达的细胞疫苗刺激组（MHCCTL）以及野生型对照组（WCTL）(P<0.05)，透射电镜显示靶细胞受到攻击后出现不同程度凋亡样坏死和胀亡样坏死，胀亡样坏死细胞在高免疫原性细胞疫苗刺激的效应细胞组较多。结论介导细胞胀亡是高免疫原性即膜型HSP70和MHCI类分子双高表达疫苗的U251细胞疫苗一种重要主动特异性抗瘤机制。【关键词】基

3、因,MHCⅠ类；干扰素Ⅱ型；热休克蛋白质70；神经胶质瘤；细胞系,肿瘤；癌症疫苗；免疫疗法；显微镜检查,电子9热休克蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)与主要组织相容性抗原复合体I类分子(majorhistocompatibilitycomplexclassI，MHCI)是参与抗原呈递两种重要的分子。近年来研究发现HSP参与机体特异的抗瘤免疫反应[1]，HSP表达量的多少与肿瘤免疫原性的强弱密切相关[2]；MHCI表达的增加，与MHC结合并提呈在肿瘤细胞胞上的胶质瘤特异性抗原或胶质瘤相关性抗原量亦随之增加，

4、胶质瘤的免疫原性可随其MHC表达量的增加而增加[3]。笔者先前研究证实了HSP70和MHCI类分子双高表达人多形性胶质母细胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）U251细胞疫苗具有高免疫原性[4]。本研究观察该类高免疫原胶质瘤细胞疫苗诱发产生效应细胞杀伤靶细胞时的超微结构变化。1材料与方法1.1材料1.1材料人多形胶质母细胞瘤细胞U251细胞（中科院上海生命科学研究所）；SGC7901胃癌细胞株（福建医科大学药理研究室）；RPMI1640（美国Gibcorl公司）；小牛血清（美国Hyclone公司）；含5%E

5、DTATypsin(美国Gibcorl公司);3（4，5二甲基2噻唑）2，59二苯基溴化四唑（MTT，上海生物工程公司)；丝裂霉素（日本KyowaHakkoKogyo有限公司）。1.2方法1.2.1GBMU251细胞的热免疫诱导分组及效应细胞的制备取对数生长期、生长状态良好的U251细胞，分为500U/mL干扰素γ(interferongamma，IFNγ)诱导48h组；热43℃休克2h组；先500U/mLIFNγ诱导48h+后热43℃休克2h共3个诱导组。单因素热43℃休克2h诱导组和双因素先500U/mLIFN

6、γ诱导48h+后热43℃休克2h后，立即放回37℃孵箱恢复2h收集细胞。分别取上述3组细胞及未经任何刺激的处于对数生长期野生型U251细胞单细胞悬液（野生型对照组），于0.2mg/mL的丝裂霉素（MMC）灭活2h。0.4%胎盼蓝染色检测灭活后U251细胞存活率；取健康捐献者外周血50mL以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMCs），计数，调整细胞浓度为5×106mL-1备用；将PBMCs与3种人脑胶质瘤细胞疫苗按5∶1的比例共孵以诱导产生3种不同效应细胞，即MHC

7、CTL（MHCI类分子单高表达U251细胞，经灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞）、HSPCTL（膜型HSP70分子单高表达U251细胞，经灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞）、MHCHSPCTL（膜型HSP70及MHCI双高表达的U251细胞，经灭活制成高免疫原性细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞）及W9CTL（野生型U251细胞直接灭活制成的细胞疫苗，体外刺激PBMCs形成的效应细胞），7d后以密度梯度离心法去除瘤苗获得效应细胞。1.2.2MTT比色法检测效应细胞体外特异性杀伤

8、活性将上述4种效应细胞分为4组即MHCCTL组、HSPCTL组、MHCHSPCTL组及WCTL组与靶细胞按比例加于96孔板中，每孔200μL，不足部分加含10%小牛血清RPMI1640培养液，每