胃癌细胞CXCR1沉默前后差异蛋白的筛选与鉴定

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1、中图分类号UDCR36610硕士学位论文学校代码10533胃癌细胞CXCRl沉默前后差异蛋白的筛选与鉴定ScreenandIdentificationoftheD。fferentialProteinsScreenand1dentltication0eDllterentlat'roteln‘G,"；tricCarcinomaCellwith／withoutCXCRlintjastrtcarctnomaellwitIi／wItonSilence作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：胡婉

2、明基础医学病理学与病理生理学基础医学院李景和副教授⋯⋯一订一一席辑中南大学二O一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：型型学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据

3、国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。鲧：丝年鲫丑日摘要胃癌细胞CXCRl沉默前后差异蛋白的筛选与鉴定目的：通过蛋白质组学研究，筛选和鉴定CXCRlshRNA质粒稳定转染胃癌MKN45细胞系(si．CXCRl．MKN45)与空载体稳定转染MKN45细胞系(si．Scrambled．MKN

4、45)之间差异表达的蛋白质。方法：首先分别建立两种稳定转染细胞系，将CXCRlshRNA质粒和空白质粒分别转染入人源性胃癌细胞系MKN45，通过G418筛选，构建稳定低表达CXCRl蛋白的细胞系(si．CXCRl．MKN45)和对照组细胞系(si．Scrambled．MKN45)。通过real．time．PCR和Western．blotting检测转染细胞CXCRl的表达情况。然后分别抽提两组细胞的总蛋白，每组蛋白平行进行3次双向凝胶电泳(two．dimensionalelectrophoresis

5、，2．DE)，ImageMaster图像分析软件进行图像分析，获得这两个细胞系的蛋白裂解产物双向凝胶电泳的差异表达蛋白质图谱，选择其中具有两倍差异表达以上的蛋白质点采用反射式基质辅助激光解吸附电离串联飞行时间质谱(MALDI．TOF／TOF)技术进行分析。并用Western．blotting方法验证了其中5个关键点蛋白质Keratin8，NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK在细胞系中的表达情况。结果：在si．CXCRl．MKN45和si．Scrambled．MKN45两组细胞系中，共识

6、别了101个差异表达的蛋白质点，57个蛋白质点在CXCRl沉默后表达下调，30个蛋白质点表达上调，6个蛋白质点完全消失，另外出现了8个新的蛋白质点。选择其中两组细胞中具有两倍差异表达以上的29个蛋白质点进行质谱分析，成功鉴定出27种蛋白质。根据功能可以将这些差异表达蛋白分为6类：1分子伴侣2信号转导蛋白3细胞骨架蛋白4转录蛋白5钙结合蛋白6代谢相关酶类。分别为：HSP27，SETtranslocation，GrpE—like1，hnRNPC(C1／C2)，hnRNPK，hCG2020155，clat

7、hrinlightchainA，Keratin8，alanyl-tRNAsynthetasevariant，importinsubunitalpha一4，cardiacventricularmyosin，Alg-2，sorcin，NADHdehydrogenase，galactokinase，NDPKA，NDPKB，methylthioribose一1一phosphateisomerase，chymotrypsinogen，PMPCBprotein，phosphoserinephosphatase，

8、KIAA0088，ATPsynthase，IIMetaxin·2，Enoyl—CoenzymeAHydratase。Western-blotting验证发现NDPKA，HSP27，sorcin，hnRNPK蛋白在si．CXCR1．MKN45细胞系中的表达量明显低于其在si．Scrambled．MKN45对照细胞系中的表达量，而Keratin8的表达量在si．CXCRl．1VIKN45细胞系中明显升高，与双向电泳技术结果相一致。结论：1．鉴定出27种与CXCRl相关的蛋