基于一维DNA组装磁性纳米探针的夹心型安培免疫传感器研究

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第l1期2011年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl634～1640基于一维DNA组装磁性纳米探针的夹心型安培免疫传感器研究巫远招干宁¨胡富陶李天华曹玉廷郑磊(宁波大学新型功能材料及其制备科学国家重点实验室基地，材化学院，宁波315211)(南方医科大学南方医院检验科，广州410003)摘要采用FeO(核)／ZrO(壳)纳米磁珠(ZMPs)标记待测物识别抗体，并用HRP酶封闭和DNA链接，建立了一类新型的“珠链状”一维磁性纳米探针制备方法。将甲胎蛋白(AFP)一抗固定于纳米金修饰的

2、玻碳电极表面，构建了免疫电极(GCElAFPAb。)。基于该电极和上述合成探针，通过双抗体夹心法测定免疫产物上HRP酶对过氧化脲(cP)氧化对苯二酚反应的催化电流，研制了一类基于一维纳米结构组装的夹心型安培免疫传感器。研究表明：此一维纳米结构探针不仅大大增加了酶在电极表面的富集量，成倍扩增了催化电流，显著提高了传感器的灵敏度，而且易于通过外磁场与背景液可控分离，简化了分析步骤，并提高了结果的重复性。此传感器对AFP检测的线性范围为O．O1～25g／L；检出限达4ng／L(3a)，并被用于人血清中痕量AFP的测定，结果满意。关键词脱氧核糖核酸；FeO／ZrO；一维磁性纳米探针

3、；甲胎蛋白；夹心型安培免疫传感器1引言甲胎蛋白(AFP)含量升高往往预示着癌症发生，故在临床上普遍作为诊断恶性肿瘤的有效指标_1]。AFP的常规检测主要采用放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELIsA)、荧光免疫法(FIA)和时间分辨荧光免疫法等。上述方法具有准确、高效等特点，但是步骤繁琐耗时、血样用量大、仪器庞大昂贵，无法满足人员流动性强的用血单位(如血站、口岸)对AFP现场快速检测的要求。因此，有必要开发高灵敏、样品用量小的便携式AFP免疫分析方法。电化学免疫法将具有高灵敏度的电化学测定技术与高特异性的免疫反应结合，相对于传统的ELISA法，具有响应快、灵敏度高、样品用

4、量小等特点，是当前临床生化检验研究的热点之一[2]。近年来，基于酶联免疫分析原理开发了夹心型安培免疫传感器，通过双抗体同时识别抗原生成“三明治”型产物，利用二抗探针表面负载酶(如}Ⅱ)催化特定底物的电化学反应，基于产生的催化电流进行定量分析。该类传感器检测灵敏度和特异性较“基于一步免疫分析”原理的传感器显著提高]。构建高灵敏的该类传感器关键是简易合成具有较高酶标记密度的探针，以放大检测信号。目前，在探针表面固定抗体的常用方法，如物理吸附、共价结合以及凝胶包埋等，存在牢固度差、繁琐耗时、生物活性下降等不足。ZrO作为一种Lewis强酸，通过与蛋白分子上的羧酸『8o]和DNA上

5、的磷酸l1。。等基团(Lewis强碱)特异性取向结合，可被直接用于固定酶及抗体。由于抗体和酶包被在极细(1～2um)且表面积很大的纳米ZrO上，标记量显著增加，且能较长时间地保持生物活性[1。DNA和ZrO。结合牢固并具有特异性l7]。但是如采用DNA直接固定ZrO。制作探针，由于与游离抗体同时存在于悬浊液中，彼此很难分离。基于纳米铁磁性氧化物(如Fe0)材料构建磁性纳米探针，并在外磁场作用下可控分离结合探针与游离抗体的方法，具有方便、简单、快速、彻底等特点。本课题组合成了Fe0(核)／ZrO(壳)磁性纳米材料(简称zMPs)_l，适于构建该类磁性探针。由于夹心免疫传感器的

6、电流响应和探针表面标记酶浓度呈正比；而DNA作为一维长链分子含有大量的磷酸基团，可固定多个HRP酶联AFP抗体(zMPs—HRP—AFPAb)磁珠，进而提高探针表面HRP酶标记量，因此可显著扩增201卜02-08收稿；201卜05—2O接受本文系国家自然科学青年基金(No．20805024)。广东省科技计划项目(Nos．2010A0303000006，2008A050200006)和宁波大学王宽诚基金资助项目E-mail：ganning@nbu．edu．cn；nflab@126．corn第11期巫远招等：基于一维DNA组装磁性纳米探针的夹心型安培免疫传感器研究电流响应。本研

7、究通过DNA连接多个ZMPs—HRP—AFPAb：纳米磁珠，采用外磁场分离后，制备了具有较高酶标记密度的一维磁性纳米结构探针(DNA／(ZMPs—HRP—AFPAb：))；基于纳米金修饰的玻碳电极固定AFP一抗(GCEfAFPAb。)作为免疫电极，构建一维磁性纳米组装的夹心型安培免疫传感器，用于AFP的测定。2实验部分2．1仪器与试剂CHI一660B电化学分析工作站(上海辰华仪器公司)；三电极体系：玻碳修饰电极(GCE，直径2mm)为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极；1-1-7650型透射