基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器

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1、基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器作者：干宁王鲁雁李天华郑磊王峰【摘要】在玻碳电极(GCE)表面固定对H2O2有催化还原活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(GCE

2、CuL);再在GCE

3、CuL表面修饰一层金磁微粒壳聚糖复合膜(nanoAu/Fe3O4/Chit),进而固定艾滋病毒(HIV)诊断标志物——包膜糖蛋白(gp160)抗体(antigp160),由此构建了一类快速检测gp160的无试剂安培免疫传感器。当该传感器在含gp160溶液中37℃下温育30min后,传感器表面生成的免疫复合物随gp160浓度

4、的增大而增加,导致CuL对H2O2电催化还原效果降低,催化电流呈现下降趋势。在PBS溶液(pH7.0)和-300mV下,催化电流的降低值ΔIo与gp160浓度在1～400μg/L呈线性关系;检出限为0.5μg/L(3σ)。研制的免疫传感器检测gp160时,一步免疫反应即可得结果,较相同条件下包被gp160抗体的纳米金单分子层修饰电极灵敏度更高,检测范围更宽,有望用于艾滋病人血清标志物gp160快速筛测。【关键词】富马酸二甲酯联吡啶铜,纳米金,磁性微粒,壳聚糖,艾滋病毒，包膜糖蛋白,安培免疫传感器　　1引言16　　人类免疫缺

5、陷病毒(HIV)感染的早期检出对杜绝艾滋病传播极其重要,常用的艾滋病诊断方式是抗体检测[1]。在艾滋病毒感染早期,人体内尚未出现抗体(即“窗口期”),已具有很强的传染性[2]。此时，“窗口期”HIV的诊断标志物——包膜糖蛋白抗原(gp160)已经存在于人血清中,但含量很低(<8μg/L),若能对其检测将有效缩短诊断“窗口期”[3]。目前,主要采用化学发光酶联免疫(ELISA)法检测痕量gp160[3],该法虽然结果准确,但是操作繁琐、仪器昂贵,限制了其推广。电化学免疫分析具有操作简便、样品量少、快速灵敏等特点,已应用

6、于临床检测[4～9]。由于缺乏简单而又能长期保持抗体生物活性的电极固定方法,且通常需要在反应体系中加入电子媒介体(eT)以加速电子传递,导致基底干扰并使抗体失活,限制了其应用[5～9]。近年来,通过在金胶等具有良好生物兼容性的纳米颗粒上包被抗体,并将其与eT共固定到电极表面,获得了灵敏度高、无需外加eT、且抗体不易失活的无试剂安培免疫传感器[10～14]。He等[9]通过在电极表面的壳聚糖(Chit)膜上层层电沉积纳米金,包被癌胚抗原(CEA)抗体,获得了测定CEA的安培免疫传感器。由于电极表面有多层纳米金,比单分子层纳米

7、金吸附更多抗体,因此在检测CEA时线性范围更宽,灵敏度更高。然而该电极检测需在电解池中加铁氰化钾作eT,体系复杂，易导致抗体失活,且电极表面需多步纳米修饰,操作繁琐。本研究组在单分散Fe3O4微粒表面负载纳米金,合成了nanoAu/Fe3O4金磁性微粒[12]。在每个Fe3O4微粒表面包裹着多个纳米金,再接枝到电极表面形成单分子层将比单层纳米金吸附更多抗体,16扩展传感器检测范围,提高灵敏度。某些铜配合物具有催化H2O2活性,可代替H2O2酶被修饰在电极表面制作H2O2传感器[15]。基于以上思路,本实验合成了对H2O2具

8、有催化活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(CuL)[16],将其与gp160抗体包被金磁微粒壳聚糖复合膜共固定在GCE上,制备了gp160免疫传感电极,并用于血清样本检验。2实验部分　　2.1仪器与试剂　　CHI660B电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极体系：GCE

9、CuL/nanoAu/Fe3O4/Chit/antigp160(φ=2mm)为工作电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极;Easysizer20激光粒度仪(美国欧美克公司);VF320型X射线荧光光谱仪(日本岛津公司);PHI5400X射线光电子能

10、谱仪(美国PE公司),HitachiX650扫描电镜(日本Hitachi公司)。　　直径50～400nm的Fe3O4微粒(美国Fluka公司);3巯丙基三乙氧基硅烷(95%)、壳聚糖(Chit,脱乙酰度>90.0%)及AuCl3·HCl·4H2O购自上海国药试剂公司。人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA试剂盒(美国ADL公司)：包括不同浓度(0～500μg/L)的gp160抗原和单克隆gp160抗体(Antigp160);牛血清蛋白(BSA,1696%～99%)与人血清蛋白(HSA,96%～99%)购自美

11、国Sigma公司。其它试剂均为分析纯,实验用水为超纯水(美国Millipore纯水器)。　　2.2NanoAu/Fe3O4/Chit共聚物合成　　按文献[16]合成富马酸二甲酯联吡啶铜([Cu(bpy)2(H2O)]2(C6H8O4)2(ClO4)4)。NanoAu/Fe3O4溶胶参考文献[10～12]