Primerpremier50设计pcr引物

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1、1.安装软件Primerpremier5.0。程序下载：PrimerPremier 5.0 http://www.bbioo.com/Soft/2005/114.htm2.程序中双击打开3.点FILE---NEW—DNASEQUENCE如图所示。1.输入目的基因片段，可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内，后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。2.选中enzyme图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏6.选中OK键，分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶7.选中primer图标，点

2、S图标，editprimer,开始设计正义链。8.软件默认引物为25个碱基9.可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7－9个碱基，保留16－18个配对即可10．在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基，入该图加入HINDIII酶切位点及TTA保护碱基，完成后点analyze，认为可以后点OK。11.选中左上角A图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。如图，选中EDITPRIMERS图标，开始设计反义链。12.从3端删除7－9个碱基同正义链。13.将酶切位点加在5端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至

3、左加入（注意不要加反）如图加入BamHI酶切位点及CGC3个保护碱基。完成后点analyze，认为可以后点OK。14.最后分析结果如图，反义链的FALSEPRIMING可以不考虑，RATING表示引物评分也可以不考虑，主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。GC含量不应超过60％15.该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印16.如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。同上输入目的基因片段，选SEARCH图标，选择参数，一般选PCRprimers---both—100至250个碱基，引物长短20＋/-2，se

4、archparametere中的参数可以不选，为默认设置。点OK。17.18．显示满足设计参数的候选结果，点OK.19.点SENES选择正义链，RATING表示引物评分，最好选评分高的。20.点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同