嵌套式PCR超灵敏检测马铃薯环腐病菌

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1、东北农业大学硕士学位论文嵌套式PCR超灵敏检测马铃薯环腐病菌姓名：何云霞申请学位级别：硕士专业：植物病理指导教师：卢翠华2003.6.1摘要要．r

2、f马铃薯种薯中存在环腐病菌潜伏侵染．这种潜伏侵染逐代累积逐渐表现症状造成危害，这是马铃薯环腐病无法根除的根本原因。因此，能够检测马铃薯种薯中微量环腐菌的插入因子IS』凹，、高度重复的DNA片段设计的环腐病菌亚种特异性引物序列合成出引物对删sIFl删sIRl和引物对CMSIF2堋IR2．由于引物对CKSIFl-CMSIRl和引物对CMSIF2一CMSIR2序列中的G、C的含量较高，在反应体系中适当加入甲酰胺，比较实验结果甲酰胺可大大降低错配

3、率，提高了特异性片段的产量。分别以环腐菌基因组DNA和菌悬液为模板进行直接PCR，结果表明以菌悬液为模板仍可同样得到特异性片段(直接PCR以引物对CMSIFl-L]／ISIRl扩增出1046bp的片段)，这个结果大大简化了提取细菌基因组DNA的步骤。分别以环腐菌菌悬液和直接PCR产物为模板应用嵌套式PCR中的引物对CMSIF2-CMSIR2进行扩增，结果表明只有经过直接PCR扩增嵌套式PcR扩增才有特异性产物产生。以环腐标准菌株、黑龙江省环腐菌株以及马铃薯上其它主要的细菌病原菌(青枯病、软腐病、黑胫病)为实验材料进行直接PCR和嵌套式PCR扩增，结果只有环腐标准菌株和黑龙江省环腐菌株

4、出现特异性片段(直接PCR扩增出1046bp的片段，嵌套式PCR扩增出864bp的片段)。将环腐菌纯菌种菌悬液稀释成浓度梯度并与马铃薯组织液混合进行直接PCR和嵌套式PCR检测灵敏度比较，结果表明嵌套式PCR检测灵敏度比直接PCR检测灵敏度提高了i00—1000倍，同时与间接ELISA方法检测灵敏度进行了比较。以明显感病症状的块茎、无明显感病症状的块茎和健康块茎为实验材料进行直接PCR和嵌套式PCR，结果为所有无明显感病症状的块茎均被检测出带有环腐病菌。，／关键词：马铃薯环腐瘸≤分子轾氯；嵌套妊cR。东北农业大学农学硕士学位论文NESTEDPCRFORIⅡTRASENSITIⅦDET

5、ECTION0FTHEPOTAT0RINGRoTBACTERIUMABSTRACTThereislatentinfectionofClavibactermichiganensissubsp．sepedonicusinpotatotissues．Thelatentinfectionaccumulatesforgenerationsandshowsobviouss2,mptomsfinally．Itisthebasicreasonthattheringrotofpotatocan’tbeeliminatedthoroughly．Soitisessentialtodetectthetiny

6、quantityClavibactermichiganensissubsp．sepedonicusinpotatotissues．Inordertofindarapid，accurate，sensitiveandreliablemethodofmoleculardetectionofClavibactermichiganensissubsp．sepedonicuswereferedtomanymaterialsanddecidedtostudyusingNestedPCRtodetectClavibactermichiganensissubsp．sepedonicusWefirstp

7、reparedtheprimerpairsCMSIFI·CMSIRIandCMSIF2-CMSIR2，designedbasedonthesequenceofthe1．3kbinsertionelementISll21，ahighrepeatedsegmentofDNAthatispresentinplasmidpCSlandinthechromosomeofClavibactermichiganensissubsp．sepedonicus，reportedsuccessfully．FormamideWasaddedtothereactionmixturebecausethecont

8、entofGandCoftheprimerpaimCMSIFl一CMSIRlandCMSIF2-CMSIR2isbigger．Theresultsshowthatformamidecanreducethemismatchingrateandincreasethespecificfragmentproduction．ThegenomicDNAandsuspensionofClavibacterraichiganensissubsp．sepedonicusWe