SN 1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１３５．５—２００７马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊狊狌犫狊狆．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊２００７１２２４发布２００８０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１１３５．５—２００７前言ＳＮ／Ｔ１１３５共分为五个部分：———马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；———马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；———马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法；———马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法；———马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法。本部分是ＳＮ／Ｔ１１３５的第５部分。本部分的附录Ｂ、附录Ｃ均为

2、规范性附录，附录Ａ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、陈红运、梁新苗、张乐、朱水芳、魏梅生。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１１３５．５—２００７马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法１范围ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分规定了马铃薯环腐病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于所有进出境马铃薯种薯及商品用薯的检疫和鉴定。２术语和定义下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ１１３５的本部分。２．１双抗体夹心酶联免疫吸附测定在固相支持物上（酶联板）包被细菌特异性抗体，加入待测样品后，再用酶

3、标记的细菌抗体进行免疫识别，最后通过酶促化学反应检测细菌是否存在的一种血清学检测方法。２．２犘犆犚以耐热ＤＮＡ聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的ＤＮＡ片段）通过高温（ＤＮＡ分子变性）和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热ＤＮＡ聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。３原理马铃薯环腐病菌（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊ｓｕｂｓｐ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊），属厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）厚壁细菌纲（Ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａ）棒形杆菌属（犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉），依靠病薯进行远距离传播。寄主及世界分布参见附录Ａ。４仪器和用具４．１仪器设备ＰＣＲ仪、超净

4、工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪。４．２主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。ＰＣＲ缓冲液、氯化镁（ＭｇＣｌ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、２ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）、磷酸二氢钾（ＫＨ）、硫酸镁（ＭｇＳＯ）、葡萄糖、琼脂，酶联检测试剂见附录Ｂ。２ＰＯ４４５病菌的鉴定５．１症状检查取样品量１％～５％（若样品少可适量增大比例）的块茎进行检查。将块茎横切，检查环腐病菌侵染症状，挤压块茎，检查维管组织是否浸

5、解。发病轻者维管束变黄，呈不连续的点状变色；重者整个维管束环变色。病菌也可侵害块茎维管束周围的薄壁组织，呈环状腐烂，严重时可引起皮层与髓部组织分离，轻轻挤压块茎从维管束中涌出奶酪样的柱状物。块茎表面的症状在轻度危害时不明显，随病害发展，皮色变暗或变褐，严重时表皮可出现裂缝。５．２双抗体夹心酶联免疫吸附测定利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录Ｂ），若检测结果为阳性，需进行病原１犛犖／犜１１３５．５—２００７菌的分离培养及５．４方法测定。５．３病原菌的分离培养５．３．１培养基的制备营养肉汤酵母膏培养基（ＮＢＹ）：牛肉汁８．０ｇ，酵母膏２．０ｇ，磷酸氢二钾（Ｋ）２．０ｇ，磷酸二

6、２ＨＰＯ４氢钾（ＫＨ）０．５ｇ，葡萄糖２．５ｇ，琼脂１５．０ｇ，水１Ｌ，灭菌后加１ｍＬ过滤灭菌的１ｍｏｌ／Ｌ硫酸镁２ＰＯ４（ＭｇＳＯ）溶液。４５．３．２块茎中病原菌的分离培养马铃薯块茎洗净后用７５％乙醇表面消毒５ｍｉｎ，从带病薯块的维管束挑取少量菌脓在ＮＢＹ培养基上划线或从带病块茎的维管束圈切取少量病组织，在灭菌水中捣碎制成悬浮液，用接菌环蘸菌悬液划线，经两次纯化培养后转入培养基斜面。５．４犘犆犚凝胶电泳检测见附录Ｃ。６结果判定若酶联免疫检测结果为阳性，可初步判定为检出马铃薯环腐病菌，需利用５．４方法进一步检测。在５．４检测中，若ＰＣＲ凝胶电泳检测结果为阳性，而且扩增片段大小与描述相符可判

7、定为马铃薯环腐病菌。７样品保存与复核７．１样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯环腐病菌的样品应保存于４℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。７．２菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为马铃薯环腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于ＮＢＹ培养基斜面上，２８℃培养４８ｈ，然后４℃冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入２０％灭菌甘油并混匀，－８０℃长期保存或用安瓿管冷冻干燥长期保