中药中香豆素类化合物的提取分离技术

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山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院山西生物应用职业技术学院中药化学实用技术 学习情景四——中药中香豆素(Coumarin)类化学成分的提取分离技术 学习情境四中药中香豆素类化合物的提取分离技术2掌握秦皮中香豆素的提取分离原理及操作技术；熟悉蛇床子中香豆素的提取分离原理及操作技术；了解前胡中香豆素的提取分离原理及操作技术。知识要求3能力要求学习目标1掌握中药中香豆素类化学成分的提取分离原理及操作技术。熟练进行秦皮、蛇床子中香豆素的提取分离操作；能进行前胡中香豆素的提取分离操作。 教学内容学习提示香豆素类化学成分的结构、性质及提取分离知识任务一实训秦皮中香豆素类化合物的提取分离技术秦皮中香豆素类成分的的提取分离及鉴定 学习提示香豆素的结构与特点一二三香豆素的理化性质及检识香豆素类化学成分的提取分离 命名香豆素最早由豆科植物香豆中提取获得，并且具有芳香气味，故而命名为香豆素。定义是具有苯骈α-吡喃酮母核的一类天然化合物的总称，在结构上可以看成是顺邻羟基桂皮酸失水而成的内酯。分布与活性广泛分布于高等植物中，特别在被子植物如伞形科、芸香科、豆科等科中多见。在某些真菌中也发现有香豆素成分的存在。香豆素有多方面的生理活性，祖师麻中分离的瑞香素有抗炎和止痛作用；蛇床子中分离出的蛇床子素能治疗脚癣、湿疹等病。香豆素顺式邻羟基桂皮酸苯骈α-吡喃酮 一、香豆素的结构类型简单香豆素类呋喃香豆素类吡喃香豆素类其他香豆素 简单香豆素仅在苯核上具有取代基的香豆素。常见取代基为羟基、甲氧基、亚甲氧基和异戊烯氧基等。这一类香豆素多数在C7位上连有含氧基团，7-羟基香豆素（伞形花内酯）可以认为是香豆素类成分的母体，其他如在C5、C6、C8位上也会有含氧基团取代。异戊烯基常连接在C6和C8上。 呋喃香豆素由香豆素核上的异戊烯基与邻位酚羟基环合而成。成环后有时可因降解而失去3个C原子。呋喃香豆素又分为线型和角型两种类型。1.线型分子由C6-异戊烯基与C7-羟基环合而成（即6，7-呋喃香1.豆），3个环是处于一直线上的；补骨脂内酯花椒毒内酯2.角形分子由C8-异戊烯基与C7-羟基成环（即7，8-呋喃香素），三个环处在一折线上。异补骨脂茴芹内酯 吡喃香豆素由香豆素苯环上异戊烯基和邻位羟基环合形成2，2-二甲基α-吡喃环结构。同呋喃香豆素类似，也分成线型（6，7-吡喃香豆素）和角型（7，8-吡喃香豆素）两种类型[根据酬和位置分]。花椒内酯邪蒿内酯 其他香豆素主要包括指在α-吡喃酮环上有取代的一类香豆素（多在C3或C4上，例如calanolideA）；双香豆素类（双七叶内脂）；异香豆素类（茵陈内脂）。calanolideA茵陈内酯紫苜蓿酚 内酯环的水解二、香豆素的理化性质溶解性性状显色反应游离香豆素多为结晶性物质，有一定熔点，多有芳香气味。分子量小的有挥发性，能随水蒸气蒸出，并能升华。香豆素苷多数无香味和挥发性，也不能升华。α、β-不饱和内酯环在稀碱液的条件下，可被水解开环，生成顺邻羟基桂皮酸盐，该盐经酸化即闭环恢复成原来的内酯结构，该性质可用于提取分离。1.内酯的颜色反应（异羟肟酸铁反应）2.酚羟基的颜色反应3.Gibb’s反应4.Emerson反应游离香豆素能溶于沸水，易溶于甲（乙）醇、氯仿、乙醚等，可溶于石油醚。香豆素苷类能溶于水、甲醇、乙醇，而难溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。荧光性香豆素母核本身无荧光，但羟基香豆素类化合物在紫外光下大多显蓝色或蓝绿色荧光，在碱液中更加显著。香豆素的荧光性质可用于香豆素成分的检识鉴别。色谱检识1.薄层色谱法2.纸色谱法 内酯环的水解【注】如果与碱液长时间加热，水解产物顺邻羟桂皮酸衍生物则转变为反邻羟基桂皮酸的衍生物，再经酸化也不能环合成内酯，故提取时要注意碱的浓度与作用时间。 内酯的颜色反应“异羟肟酸铁反应”在碱性条件下，内酯开环，与盐酸羟胺中的羟基缩合生成异羟肟酸，然后在酸性条件下再与三价铁盐络合而显红色。 酚羟基的颜色反应①三氯化铁反应具有酚羟基取代的香豆素类在水溶液中可与Fe3+络合而产生绿色至墨绿色沉淀。②重氮化反应若酚羟基的邻对位无取代时，可与重氮化试剂反应产生红色至紫红色。 其他的颜色反应①Gibb’s反应香豆素类成分在碱性条件（pH9~10）下内酯环水解生成酚羟基，如果其对位（6位）无取代，与2，6－二氯苯醌氯亚胺（Gibb’s试剂）反应显蓝色。②Emerson反应与Gibb’s反应类似，香豆素类成分如在6位无取代，内酯环在碱性条件下开环后与4－氨基安替比林和铁氰化钾（Emerson试剂）显红色。 三香豆素的提取与分离溶剂提取法香豆素的提取与分离提取分离碱溶酸沉法水蒸气蒸馏法色谱法酸碱分离法超临界流体萃取法分步结晶法真空升华或蒸馏法 （一）香豆素的提取溶剂提取法：香豆素类成分的极性不同，各种溶剂都有提出该成分的可能。当利用极性由小到大的溶剂顺次萃取时，各萃取液浓缩后都有可能获得结晶，再结合其他分离方法进行分离。碱溶酸沉法：香豆素类具有内酯结构，能溶于稀碱液与脂溶性杂质分离，再经酸化使内酯环合，香豆素类成分即可析出，也可用乙醚等有机溶剂萃取得到。但在碱水中加热的时间不可过长，以防香豆素开环后发生异构化。水蒸气蒸馏法：小分子的游离香豆素因具有挥发性，可用水蒸气蒸馏法进行提取。超临界流体提取法：超临界流体提取新技术已被广泛应用于香豆素类成分的提取中。极性小的游离香豆素可直接提取，而苷类则可通过加入乙醇等极性溶剂作夹带剂来提取。 （二）香豆素的分离酸碱分离法：弱酸性和中性香豆素的混合物，可利用碱水酸沉法分离。色谱法：柱色谱分离中多采用硅胶吸附剂，慎用氧化铝，否则会使香豆素结构发生变化。此外还可用葡聚糖凝胶色谱进行分离。分步结晶法：该方法适用于含量较高的香豆素。可利用含氧香豆素在石油醚中溶解度小的特点，在含香豆素的乙醚提取液中，逐步加人石油醚，使香豆素逐步析出。真空升华或蒸馏法：香豆素类易升华的性质使之与不挥发性成分分开。对于热稳定性好的香豆素，此法是非常方便实用的。但对于热不稳定的香豆素往往会因此引起重排或降解。 任务一秦皮中香豆素类化学成分的提取分离技术学习目标一二三秦皮中香豆素类化学成分的提取分离技术必备知识五四六相关知识链接及拓展课堂互动目标测试 一学习目标2掌握秦皮中香豆素类化合物的提取、分离及鉴定技术。熟悉秦皮中香豆素类化合物的结构及性质。了解秦皮中香豆素类化合物的存在及生物活性。知识要求3能力要求1掌握秦皮中香豆素类化学成分的提取分离原理及操作技术。熟练进行秦皮中香豆素类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会秦皮中香豆素类化合物的色谱鉴定技术。学习目的 二秦皮中香豆素类化学成分的提取分离技术秦皮为木犀科植物苦栎白蜡树FraxiuusrhyuchophyllaHance.、白蜡树F.chinensisRoxb.、尖叶白蜡树F.chinensisRoxb.Var.acuminateLingelsh.或宿柱白蜡树F.stylosaLingelsh.的干燥枝皮或干皮。具有清热燥湿、收涩、明目等功效。临床主治慢性菌痢，对慢性支气管炎亦有一定疗效。秦皮含有七叶内酯、七叶苷、秦皮素以及秦皮苷等香豆素类化合物，此外还有鞣质、皂苷、树脂和脂溶性色素等成分。七叶内酯和七叶苷为其主要成分，具有抗炎、镇痛、止咳、祛痰与平喘等功效。 秦皮中七叶内酯和七叶苷的提取分离工艺流程 课堂互动用95%乙醇回流提取和减压浓缩是各应注意什么问题? （三）秦皮中香豆素类的提取分离（二）秦皮中主要有效成分的性质（一）秦皮中主要有效成分及结构三必备知识 （一）秦皮中主要有效成分及结构秦皮含有七叶内酯、七叶苷、秦皮素以及秦皮苷等香豆素类化合物，此外还有鞣质、皂苷、树脂和脂溶性色素等成分。七叶内酯和七叶苷为其主要成分，具有抗炎、镇痛、止咳、祛痰与平喘等功效。 glc-O七叶内酯七叶苷（二）秦皮中主要有效成分的性质七叶内酯(aescule-tin,七叶素）为无色或淡黄色针状结晶，熔点276℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、稀碱水，略溶于水，难溶于氯仿等亲脂性有机溶剂；七叶苷(aesculin)为无色或浅黄色针状结晶，熔点206℃，溶于甲醇、乙醇、碱水或水，难溶于乙酸乙脂，不溶于氯仿。两者均显明显的蓝色荧光。 （二）秦皮中主要有效成分的性质秦皮素(fraxetin)分子式C10H8O5，相对分子质量208.16。片状结晶（乙醇水溶液），熔点227～228℃。溶于乙醇及盐酸水溶液，微溶于乙醚和沸水。秦皮苷(fraxin)分子式C16H18O10，相对分子质量370.30。水合物为黄色针状结晶（水或稀乙醇溶液），无水物熔点205℃。微溶于冷水，易溶于热乙醇及热水。秦皮素R=H秦皮苷R=glu 12提取分离依据根据秦皮中七叶苷和七叶内酯均溶于热乙醇的性质，用乙醇为溶剂进行回流提取。利用七叶苷和七叶内酯均不溶于氯仿的性质除去亲脂性杂质。利用在乙酸乙酯中的溶解度差异分离二者。（三）秦皮中香豆素类成分的提取分离 苦枥白蜡树中秦皮素、秦皮苷的提取分离 四知识拓展（一）白蜡树树皮中七叶素的提取分离索氏提取器内，用95%乙醇回流提取，回收溶剂，浓缩物加硫酸水浴加热后冷却过滤，滤液用乙醚萃取，回收乙醚，放置析晶，甲醇重结晶得七叶素。工艺流程如下： 四知识拓展（二）苦枥白蜡树中秦皮素、秦皮苷的提取分离工艺流程如下： 四知识拓展（三）白蜡树树皮中七叶素的提取分离工艺流程 任务二蛇床子中香豆素类化学成分的提取分离学习目标一二三蛇床子中香豆素类化学成分的提取分离必备知识五四六相关知识链接及拓展课堂互动目标测试 一学习目标2掌握蛇床子中香豆素类化合物的提取、分离及鉴定技术。熟悉蛇床子中香豆素类化合物的结构及性质。了解蛇床子中香豆素类化合物的存在及生物活性。知识要求3能力要求1掌握蛇床子中香豆素类化学成分的提取分离原理及操作技术。熟练进行蛇床子中香豆素类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会蛇床子中香豆素类化合物的色谱鉴定技术。学习目的 二蛇床子中香豆素类化学成分提取分离技术蛇床子为伞形科植物Cnidiummonnieri(L.)Cuss的果实。主产于河北、山东、江苏等地。具有温肾助阳，祛风燥湿，杀虫的功能，用于男子阳痿，阴囊湿痒，女子带下阴痒、宫寒不孕、风湿痹痛、疥癣湿疮等的治疗。 蛇床子中蛇床子素和欧前胡素的提取分离工艺流程 （三）蛇床子中主要有效成分的提取分离（二）蛇床子中主要有效成分的性质（一）蛇床子中主要有效成分及结构三必备知识 （一）蛇床子中主要有效成分蛇床子主含挥发油和香豆素类成分。果实含挥发油1.3%。香豆素类成分包括蛇床子素(osthole)、欧前胡(imperatorine)、佛手柑内酯(bergapten)、异虎耳草(isopimpinelline)等成分。 （二）蛇床子中香豆素类成分的结构、性质蛇床子素棱柱状结晶（乙醚），针状结晶（稀乙醇），熔点83~84℃，溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯和沸石油醚，不溶于水和冷石油醚。欧前胡素棱柱结晶（乙醚），长细针晶（热水），熔点102℃，不溶于水，易溶于沸水，易溶于氯仿、溶于苯、乙醇、乙醚、石油醚和碱性氢氧化物。 佛手柑内酯白色带丝光的针状结晶，熔点188~190℃，易溶于氯仿，微溶于苯、乙酸乙酯和乙醇，不溶于水，具有升华性。异虎耳草素淡黄色结晶，熔点189~191℃。 课堂互动蛇床子中化学成分的溶解性有什么特点？如何利用其特点进行提取分离？ 抗心律失常作用（三）蛇床子中香豆素类成分的生物活性生物活性抗菌、抗病毒作用抗变态反应蛇床子素对须发藓菌有较强抑制作用，花椒毒酚则具有显著的抗霉菌作用。蛇床子总香豆素能直接扩张豚鼠器官平滑肌，对豚鼠吸入致痉剂所致的药物性哮喘有明显的保护作用，在体外能拮抗组织胺、慢反应物质引起的肠肌收缩，对小鼠被动性皮肤过敏反应有抑制作用，同时有一定的祛痰作用。抗炎作用蛇床子素具有钙拮抗剂的作用。蛇床子总香豆素对角叉菜胶和鸡蛋清引起的大鼠足趾肿胀均有明显的抑制作用。。 四知识拓展蛇床子膏的制备工艺流程蛇床子粗粉用70%乙醇浸提3次，合并提取液，减压回收乙醇，得稠膏。然后加稠膏3倍量的氯仿回流提取，过滤，减压回收氯仿，得含蛇床子素的干膏。工艺流程如下： 任务三前胡中香豆素类化学成分的提取分离学习目标一二三前胡中香豆素类化学成分的提取分离必备知识五四六相关知识链接及拓展课堂互动目标测试 一学习目标2掌握前胡中香豆素类化合物的提取、分离及鉴定技术。熟悉前胡中香豆素类化合物的结构及性质。了解前胡中香豆素类化合物的存在及生物活性。知识要求3能力要求1掌握前胡中香豆素类化学成分的提取分离原理及操作技术。熟练进行前胡中香豆素类化合物的提取、分离及鉴定操作。学会前胡中香豆素类化合物的色谱鉴定技术。学习目的 二前胡中香豆素类化学成分提取分离技术前胡为伞形科植物白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn.）的干燥根。具有散风清热、降气化痰的功效，用于风热咳嗽痰多、痰热喘满、咯痰黄稠等症。主产于浙江、江西、四川等省。 白花前胡成分白花前胡丙素的提取分离工艺流程 （三）前胡中主要有效成分的提取分离（二）前胡中主要有效成分的性质（一）前胡中主要有效成分及结构三必备知识 （一）前胡中主要有效成分前胡中主要含有香豆素类化合物，主要有效成分为白花前胡丙素（PraeruptorinC）。白花前胡丙素和其消旋体白花前胡甲素为其主要活性成分，研究表明白花前胡丙素与其消旋体白花前胡甲素(praeruptorinA)具有相似的药理作用。此外，前胡中还含有白花前胡乙素（PraeruptorinB）、、白花前胡丁素（PraeruptorinD）、白花前胡戊素（PraeruptorinE）等成分。 （二）前胡中香豆素类成分的性质、结构(1)白花前胡甲素分子式C20H22O5，相对分子质量342.40。(2)白花前胡丙素分子式C21H22O7，相对分子质量386.41。白色针晶，熔点136℃～138℃。(3)白花前胡丁素分子式C24H26O7,相对分子质量426。无色针晶，熔点174℃～176℃。(4)白花前胡戊素分子式C24H28O7，相对分子质量428.46。白花前胡甲素白花前胡丙素 课堂互动根据白花前胡丙素的提取分离工艺分析白花前胡丙素的溶解性特点。 四知识链接白花前胡成分提取分离 五知识拓展商品前胡的药用原植物还有紫花前胡，但是2005版药典未收载。紫花前胡中主要含有的香豆素类成分有紫花前胡素D、紫花前胡素F、Pd-C-Ⅳ、Pd-C-Ⅱ、（+）-3/S-decursinol等成分。紫花前胡素DR1=HR2=当归酰基紫花前胡素FR1=乙酰基R2=H化合物Ⅴ—紫花前胡素D化合物Ⅵ—紫花前胡素F化合物Ⅶ—Pd-C-Ⅳ化合物Ⅷ—Pd-C-Ⅱ化合物Ⅸ—（+）-3/S-decursinol 学习小结香豆素类化合物提取分离提取、分离结构测定理化性质性状、溶解性、荧光反应、内酯环的碱水解结构类型简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素、其他香豆素应用实例紫外、红外、核磁、质谱秦皮、蛇床子、前胡检识反应显色反应、色谱检识（一）学习内容 （二）学习方法与体会香豆素类化合物由于结构特殊，既具有酯类化合物的某些特性，也具有苷类化合物的特性。在学习过程中要重点掌握香豆素的结构特点和理化性质，以及提取分离和鉴定方法。通过理论学习和实训操作使学生达到能灵活运用掌握的知识分析提取分离工艺流程的原理。具有用化学方法鉴别香豆素类化合物的能力，能设计简单的提取分离流程。 六目标检测一、选择题（一）单项选择题1、下列化合物具有强烈天蓝色荧光的是A.七叶内酯B.大黄素C.大豆皂苷D.甘草酸2、异羟肟酸铁反应的现象是A.绿色B.蓝色C.红色D.黑色3、FeCl3试剂反应的条件是A.内酯环B.酚羟基C.芳环D.甲氧基4、异羟肟酸铁反应作用的基团是A.酚羟基B.芳环C.甲氧基D.内酯环5、秦皮中的七叶内酯属于下列哪类香豆素成分A.异香豆素B.简单香豆素C.吡喃香豆素D.呋喃香豆素6、香豆素的基本母核是A.苯丙素B.顺式邻羟基桂皮酸C.苯并α-吡喃酮D.桂皮酸衍生物7、下列化合物脱水后能生成香豆素的是A.桂皮酸衍生物B.苯并α-吡喃酮C.顺式邻羟基桂皮酸D.苯丙素 8、游离香豆素可溶于热的氢氧化钠水溶液是由于其结构中存在A.酚羟基对位的活泼氢B.酮基C.甲氧基D.内酯环9、异补骨酯素属于A.呋喃香豆素B.简单香豆素C.吡喃香豆素D.异香豆素10、七叶内酯具有A.升华性B.香味C.两者均无D.两者均有（二）多项选择题1、含有香豆素的中药有A.秦皮B.厚朴C.五味子D.补骨脂E.大黄2、游离的小分子香豆素提取可用A.碱溶酸沉淀法B.水蒸气蒸馏法C.色谱法D.升华法E.有机溶剂法3、提取游离香豆素的方法有A.酸溶碱沉法B.乙醚提取法C.碱溶酸沉淀法D.热水提取法E.乙醇提取法4、蛇床子中主要含有的化学成分有A.槲皮素B.蛇床子素C.欧前胡素D.佛手柑内醋E.大黄素5、前胡中主要含有的化学成分有A.白花前胡甲素B.白花前胡戊素C.白花前胡丙素D.欧前胡素E.花色素（三）简答题1.香豆素类化合物具有哪些理化性质？2.简述薄层色谱中展开剂的pH值对弱酸性香豆素Rf值的影响离？ 实训秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离和鉴定【实训目的】1.能够运用回流和连续回流法、减压浓缩法对秦皮中七叶苷和七叶内酯进行提取和精制。2.会用显色反应、色谱法进行香豆素类成分的检识。【化学成分概述】秦皮为木樨科植物白蜡树、苦枥白蜡树、尖叶白蜡树、宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮。秦皮主要含七叶内酯、七叶苷、秦皮素、秦皮苷等，结构见前述。【实训原理】本实验是根据秦皮中的七叶内酯、七叶苷均能溶于沸乙醇，可用沸乙醇将两者提取出来，然后利用两者在醋酸乙酯中的溶解度不同进行分离。【设备、仪器及药品】索氏提取器、分液漏斗、50ml圆底烧瓶、冷凝管、水浴锅、硅胶G薄层板、紫外光灯（254nm）、95%乙醇、氯仿、醋酸乙酯、盐酸、盐酸羟胺、甲醇、氢氧化钠、三氯化铁、正丁醇、醋酸、秦皮苷标准品。 【操作步骤】1、七叶内酯、七叶苷的提取分离秦皮粗粉150g置索氏提取器中，用乙醇回流提取4次，减压浓缩，回收乙醇，得浓缩物。浓缩物用水温热溶解加等体积氯仿萃取2次，除去非极性杂质。水液挥取残留的氯仿，加等体积的醋酸乙酯萃取2次合并萃取液。水液浓缩析晶滤过，甲醇、水反复重结晶得七叶苷。醋酸乙酯液加无水硫酸钠脱水，减压蒸干，残留物用甲醇溶解，适当浓缩后放置过夜析晶滤过，水、甲醇反复重结晶的七叶素。2、鉴定（1）荧光：取样品少量，加入乙醇0.5ml，用毛细管滴于滤纸上，在紫外灯下观察。（2）三氯化铁反应：取样品少量，加入乙醇0.5ml，加入1%三氯化铁试剂2～3滴，观察颜色变化。（3）内酯的颜色反应：取样品少量，加0.5ml乙醇溶解，加10%盐酸羟胺甲 【操作步骤】醇溶液数滴，10%氢氧化钠5～6滴，水浴加热2分钟放冷后加5%盐酸数滴（pH3～4），加5%三氯化铁2～3滴，观察颜色变化。（4）薄层检识吸附剂：硅胶GF254薄层板样品：秦皮提取物1%甲醇溶液对照品：2%秦皮甲素标准品甲醇液；2%秦皮乙素标准品甲醇液展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸（6∶1∶0.5）显色：三氯化铁-铁氰化钾试液（1∶1）