《体硕士课程》PPT课件

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1、第五章载体目前所用的载体有：质粒酵母质粒噬菌体载体病毒载体粘粒酵母人工染色体按功能分为:克隆载体,表达载体第一节质粒（plasmid）一．什么是质粒[质粒]染色体外能独立复制，能稳定遗传的一种环状双链DNA分子。二．质粒的基本性质、分类和命名1．质粒的分布、大小和数目分布：细菌、酵母、霉菌和某些真核细胞大小：106-2810Dalton例子：F1：6.2106ColE1:4.2106R64:7.8106:四环素，链霉素抗药性数目严紧型松弛型拷贝数1-2/cell>10/cell复制酶大肠杆菌酶系大肠杆菌酶系F1：1-2/cell;pBR322

2、:15-20/cellColE1:10-15/cell;pUC:500-700/cell质粒的理化性质具有一般核酸分子的理化性质质粒的生物学特性寄生性──质粒只能在宿主的细胞内复制稳定性──每种质粒在寄生虫细胞中总有一定的拷贝数同源性──不同质粒之间可能存在一定的同源区。重组性──两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于同一宿主中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组不相容性──有相同复制起始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞传递性──有些质粒在细菌间能够传递、具有转移性的质粒带有一套根转移有关的基因。消除性──存在于宿主细胞中

3、的质粒，可用某些办法将它除掉。复制类型──松驰型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。表现型──不同的质粒有不同的表型特性。质粒的分类按表型效应分：①和质粒有关的性状是多方面的②质粒能控制宿主的遗传性状─载体③一种细菌可以具有不止一种表型效应如：a．大肠杆菌的致育的因子（F）b.大肠杆菌素因子（COlE1）抗药性质粒（R）分解性质粒：假单孢菌中发现，如分解樟脑的质粒特殊性质质粒：致瘤脓杆菌的质粒，寄主植物茎部长瘤状突起隐秘性质粒：没有表型效应按拷贝数分严紧型松弛型转移类型：1.转移型（接合转移）如：F因子2.非转移型如：ColE1不亲和群：可在

4、同一细菌中共存的，为不同不亲和群命名用小写字母p代表发现这一质粒的作者或实验室名称如：pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系列质粒的编号。质粒的分离和纯化细菌的培养和质粒扩增细菌的收集和裂解质粒DNA的纯化理想质粒载体所必需具备的条件1.质粒较小低分子量的质粒通常拷贝数较多克隆时所预期的基因表物的数量较大有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶谱外源DNA容量较大,质粒小容易转化（大于15kb时，成为转化效率制约因素)操作容易掌握，容易分离，不易断裂2.带有可供选择的标记对抗菌素的抗性，Amp,Tet,Cm,Ka

5、na,Neo,互补3.带有尽可能多的单一限制性酶切位点单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入；较多不同的单一限制酶酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入4.具有复制起始点质粒DNA增殖所必不可少的结构。5.作为表达载体，还要有启动子和终止子序列等片段人工组建的克隆载体pBR322历史：最早载体质pSC101,ColE1,pCR1──复制效率低没有选择标记没有2个以上克隆位点pBR322,──松弛复制，Tet和Amp抗药性，一些有用的RE切点太大，一半序列非必需pBR322,去除非必需序列，4.36kb现在的质粒多为其直系后裔构建：ColE1复制区

6、+pSC101.TcR基因+Tn3AmpR基因特点：应用：生长激素释放抑制因子的表达pUC系列pUC18/pUC19（2.69kb）pUC118/pUC119（3.2kb）一互补原理筛选用途：（1）克隆载体蓝白筛选(2）DNA序列分析118/119带有M13噬菌体的DNA合成、终止包装序列带质粒菌+M13K07辅助噬菌体产生SS.DNA,用于测序，体外诱变，链特异探针合成（3）基因表达载体融合蛋白第二节噬菌体类运载体目前使用的噬菌体类运载体系主要有：噬菌体衍生物柯斯质粒（Cosmid）M13噬菌体噬菌体运载体噬菌体的基本特点：生活史DNA结构：双链，基

7、因组大小为48.kb,线状两端带有单链12kb的互补末端，称为粘性末端从J基因到N基因部份包含有功能不清的b2基因段以及与重组、整合和切离等溶源化有关的基因。DNA长度不超过野生型DNA长度（48.6kb）的75~105%范围进行包装噬菌体运载体改造野生型DNA：突变/缺失等手段消除过多的酶切位点及非必需区在非必要区插入外源基因（如lacZ基因）改变噬菌斑的颜色、浊度等，以利筛选插入型载体：改造后使DNA分子的中心仅有几个单一酶位点插入外源DNA片段，如gt10可克隆10kb外源片段置换型载体：基因组中间部分约三分之一的基因组可以用外源基因进行替换，从