绿色荧光蛋白的研究新进展

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1、中国化工学会农药专业委员会第十三届年会论文集绿色荧光蛋白的研究新进展张海科，范志金木，马琳，贾俊超，黎锐(南开大学元素有机化学国家重点实验室，300071，天津E-mail：缸勾@nallkai．edu．cn)绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母∽窖g“o旭口vfcfD，缸)体内的生物发光蛋白，分子量为26888D，由238个氨基酸组成，该蛋白65～67位Se卜T)，r-GIy三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构。野生型GFP发光较弱，在某些植物中不能表达，而经过加工改造的GFP在动植物中均能够正常表达并且加强了荧光信

2、号，GFP作为新的报告基因和遗传标记被广泛应用于生命科学研究之中，是寻找药物的作用靶标和新药筛选的重要工具。关键词：绿色荧光蛋白(GFP)；应用。0．引言绿色荧光蛋白(GFP)是一类存在于海洋生物水母口叼“D愆口1，耙幻，．妇)体内的生物发光蛋白，近年来作为标记性蛋白广泛应用于生物化学和细胞生物学中等生命科学领域。早在1962年，Shimomura等就发现在多管水母中存在绿色荧光蛋白：后来，Morise等(1974)纯化出GFP并得到其晶体；ward等(1982)对其结构和性质进行了深入研究：而取得突破性进展的是Pras

3、her等(1992)克隆到GFP基因cDNA；ChaIfie等(1994)首次对其进行了异源表达。研究者又从其他海洋生物体中克隆到一系列GFP基因，如Stewan(2001)从RP，zf朋珊中克隆到GFP基因：KelmaJlson和Matz(2003)从胸n姗抛P口c伽朋∞口中也克隆到GFP基因。研究表明，从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同【1】。本文就绿色荧光蛋白的性质及主要应用进行总结，目的是探讨这类技术在新农药创制领域中的应用。1．绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白是238个氨基酸组成的单体蛋白，分子量为

4、27kD：GFP的生色团是通过分子内的自催化环化产生的对羟基亚苄基吡唑啉酮形成，它形成于GFP肽链的65．67位，即Ser-Ty卜Gly【2】o生色团在翻译后24h内自动催化形成，因此GFP在合成后需经过一定的折叠形成正确的构像后才具功能。GFP生色团的形成需要02，使66位氨基酸残基的a、p健间脱氢，因此，厌氧条件下GFP不能形成荧光。虽然早在1974年，科学家们就得到了GFP的晶体，1988年报道了它的衍射图，但直到1996年。眦oe【3】小组和Y抽g【4】，J、组才分别解析出了重组野生型GFP和突变型GFP的结构。

5、GFP蛋白是一个桶状结构，“圆桶”的直径是24A(1A=O．1nm)，高度是42A，11条p折叠的肽链组成圆桶壁，l条0【螺旋的肽链沿着圆桶对角线分布，荧光团附着在A螺旋结构上，刚好基金项目：天津市自然科学基金(07JCYBJC01200)、国家自然科学基金(20672062)、天津市科技支撑计划国际科技合作项目(07zCGHHz01400)和国家重点基础研究发展计划‘‘973”项目(2003CBll4402)资助作者简介：张海科(1985-)，女，山东淄博人，硕士研究生，从事新农药创制研究；范志金(1968．)，男，四

6、川乐山人，副教授，博士，从事新农药创制和农药学研究．中国化工学会农药专业委员会第十三届年会论文集埋藏在桶状柱体的中央，因此受到很好的保护，避免产生由氧分子和水合氢离子引起的荧光淬灭现象。Li掣5J证明，使GFP发光的最小序列是7．229位。GFP的荧光性能取决于整个分子的一级结构，整个肽链围绕荧光团的精确折叠保证了GFP独特的荧光性质。2．绿色荧光蛋白的性质2．1GFP的光谱特性野生型GFP有两个吸收峰，主峰在395nm，次峰在470nm，有一个发射峰在508m。之所以有两个吸收峰，是因为它的某些基因进行着质子化、去质子

7、化的转换。395砌的吸收峰对应着中性形式的发色团，而470啪的吸收峰则对应着阴离子形式的发色团，这些形式的相互转换又受到蛋白质浓度、pH、离子强度、温度等因素的影响【61。根据发色团组分的不同，TSien【7J将现在已知的GFP及其突变体分成7类：第一类是含有中性酚类和酚离子混合发色团的野生型蛋白；第二类含有酚负离子发色团；第三类含有中性酚类：第四类具有大兀电子体系的酚负离子；第五类含有吲哚：第六类含有咪唑；第七类含有苯基，每一类都有不同的激发波长和发射波长(表1)。第1-4类GFP的发色团是源于多肽66位的研，而第5．

8、7类则是源于66位的，I印、His或Phe。目前，人们较为认同GFP的作用机理是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异【81。1hble1PhotospectrumofGFPanditsmutations类别发色团类型代表物最大激发吸收系数