绿色荧光蛋白的研究进展

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1、中国畜牧兽医2008年第35卷第8期生理生化·29·绿色荧光蛋白的研究进展杨慧敏1。李文刚2，吴高锋1．魏娟1。王鑫1(1．河南农业大学，郑州450002；2．郑州牧专，郑州45001I)摘要：绿色荧光蛋白(GFP)作为一种新型、方便的报告基因，具有很多理想特性，它灵敏度高，能在细胞内稳定表达，不需要添加任何底物或辅助因子，不使用同位素，也不需要测定酶的活性等，已成为目前最优良的标记基因之一。其显著特点是在不加外源物质的情况下，受紫外光激发，就能在原核和真核活细胞中发出绿色荧光，而且荧光性质稳定，对细胞无毒，

2、其特有的生化性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。关键词：绿色荧光蛋白；荧光强度；转基因中图分类号：Q516文献标识码：A文章编号：1671—7236(2008)08一0029一03绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是20世纪90年代中期发展起来的一种全新的报告分子。同以往常用的报告基因LacZ、CAT、荧光素酶基因以及其他抗生素基因相比，GFP不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、稳定、无污染，而且可以在UV或蓝光激发下直接观察。因此，其被广泛应用于分子

3、生物学研究。Rasher等(1992)首次克隆得到多管水母的GFP基因。GFP基因由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。Chalfie等(1994)首先在大肠杆菌细胞中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快发现GFP能在多种异源细胞内表达，因此在多个学科领域引起了广泛的关注，被誉为“活细胞探针”。野生型GFP荧光强度较低，受温度影响大，其应用受到了限制。Heim等(1995)采用定点突变的方式，把第65位丝氨酸换成苏氨酸或胱氨酸，荧光强度提高了4--．6倍。后来的研究中用到的GFP突

4、变体都是在此基础上通过改变若干碱基而得到的。增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)是其中具有代表性的一种，其荧光强度显著提高，而且更适合于在哺乳动物细胞表达。1GFP作为标记基因的优点1．1不需加任何底物，荧光性质稳定GFP作为报告基因不需加任何底物且荧光非常稳定。只有在过热、过酸、过碱或添加某些变性剂的条件下，GFP才会变性，甚至荧光消失。一旦恢复中性环境，或收穰日期：2007—12—25作者简介：杨慧敏(1981一)．女．河南人，硕士生，主要从事分子

5、病毒学与免疫学研究。通讯作者：李文刚，教授。基金项目：河南省杰出人才创新基金(0621002000)．除去某些变性剂，荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱。在很大的pH范围内(7～12．2)GFP的吸收、发射光谱基本相同。1．2相对分子质量小，对细胞无毒性GFP是一种良好的标记物，分子量较小是它作为报告基因的一大优点，GFP与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，大量表达对细胞也无毒性作用，细胞仍可连续传代培养。1．3检测方便，可直接用于活体测定因为GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，也就不存在

6、这些物质可能难于进入细胞的问题，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。且可进行活体观察，不会损伤正在生长的细胞和组织。1．4无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制GFP基因的共用性首先表现在它的表达几乎没有受体范围的限制，在原核和真核生物中都获得了成功的表达，这是一种在生物界较为“通用”的基因。1．5不受假阳性干扰，灵敏度高由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果。GFP作为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散造

7、成的定位不准，使结果真实可靠。而且其灵敏度高，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。1．6可制成永久标本GFP的荧光可以耐受光漂白，也可耐受福尔马林的固定，因而可以制成长期保存的标本。2影响GFP表达强度的因素2．1表达温度对GFP荧光强度的影响尽管·30·生理生化中国畜牧兽医2008年第35卷第8期GFP荧光是稳定的，但GFP生色团的形成对温度敏感。在细胞生物学应用过程中，各种GFP突变型在高温下的正确折叠非常重要。在酵母中，当细胞在15℃生长时，GFP荧光值为最大；当培养温度升至37℃时荧光强度下降

8、约25％。有研究结果表明24℃或30℃生长的Ecoli比37℃生长时的GFP荧光更强(Heim等，1995)。同样，培养在30～33℃的哺乳动物细胞所表达的GFP比37℃时发出更强的荧光(Ogawa等，1995)。EGFP、EBFP和GFPuv含有密码子突变，增加了蛋白质折叠和色基构型的效率，从而增加了这些突变体的热稳定性，如25℃或37℃表达的GFPuv荧光强度几乎没有差异。2．2酸碱对GFP荧光