绿色荧光蛋白gfp的研究进展及应用

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1、绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）；标记物；荧光特性；进展；改进；应用Abstract：Thegreenfluorescentprotein(GFP)fromthejellyfishAequoreavietoriaisagreatpotentialforapplicationofthemarker,hasaicalproperties,thefluorescencecharacteristics,improvementandapplicationofGFParerevieprovement;Application1引

2、言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。1962年Shimomura等［1］首先从多管水母(Aequoriavictoria)中分离出一种分子量为20kD的称为Aequorin的蛋白。由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。随后，人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP，其中研究较为深入的是来自多

3、管水母科(Aequorleidae)和海紫罗兰科(Renillidae)的GFP，即AequoriaGFP和RenillaGFP。2GFP的理化性质，荧光特性及其改进2.1GFP的理化性质　　从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。AequoriaGFP分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽；而RenillaGFP是分子量为54kD的同型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱，AequoriaGFP在395nm具有最

4、高光吸收峰，肩峰为473nm；RenillaGFP在498nm具有强烈的光吸收，肩峰为470nm。两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax=508～509nm）。　　GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH＜4.0或pH＞12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内（pH7～12.2）的吸收、发射光谱也是相

5、同的。RenillaGFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。根据Sheen等［2］的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。2.2GFP的荧光原理　　GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65～67位的氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮（4-p-hydroxybene-5-imidazolinone），形成生色团（基于组成生色团的元件不同，

6、可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长）［3-5］。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450～490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性，可以在翻译后2～4h通过自动催化作用来合成。Cubitt等［6］认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等［7］提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。2.3GFP的荧光性质及应用优点［8-9］　　GFP

7、的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。　　(1)易于检测，灵敏度高。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。　　(2)荧光性质稳定。GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测时间；GFP在pH7～12范围内也能正常发光，对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。　　(3)对细胞无毒害。从目

8、前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。