猪内源性反转录病毒囊膜糖蛋白基因在大肠杆菌中的表达及初步分析

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1、沈阳农业大学硕士学位论文猪内源性反转录病毒囊膜糖蛋白基因在大肠杆菌中的表达及初步分析姓名：孟丽平申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：赵玉军;章金刚2003.6.1浚辍农业丈学硬士学坟论文襄霉要根据国内外已发表的PERV囊膜熬因的核苷酸序列，设计并合成了扩增P嚣萋敝cnv全麓因及冀编码穿膜蛋白PERV-TM(gpl5)和韩膜蛋圭IPERV-SU(gp70)基因的引物。应用PCR的方法从已建立的台商PERV-env全赫因序列静质粒(pT-e6组予)中扩增得到PERV—env全基因及其编码穿膜蛋白PERVTM和外膜蛋囟PERV-SU基因，并克

2、隆)'．pGEM-T栽体，经蓝白斑筛选、双酶切及PCR鉴定，获得PERV-elw全港困及熟编码穿膜蛋白PERV-TM和外膜，蛋f!tPERV-SU基因宠隆重缝震粒pGEM—env、pGEM-TM毒IlpGEM—su。f憋克I隆重组质粒中的目的基因片段进行序列测定，结果表明所获P掰w，env全基因全长为2004bp，包含一个竞熬熬ORF，大夺为19S3bp，编磷660令簧c蓥酸；同源性分析袭明，该撼因与法系大白猪来源的PERV-A1型囊膜基因同源性为97％，与欧_3

3、i

4、小墅猪来源静PERv囊骥基因嗣源注为82％。PERV-TM基透片段长的为60

5、0个核昔酸，编码198个氨基酸，其中含有两个保守的抗原决定簇E1(GPQQLEK)和糙(FEGWFN)，能够诱簿产生中和抗体。PERV-SU基因片段长的为1386个援：鸯酸，编码594个氨基酸，该区主要决定病毒的嗜性，并且主要依据SU表面糖基化的VRA、VRB和PRO区的差异。将PERv划分为、三秘不弱鼓瘸毒亚邀，本交隧拣经分型弓l镌签定巍PERV-A鼹型。太从克隆重组质粒上切下目的基因片段，与表达躐体连接，构建麓组表达臻粒pGEX—e嚣v。裁蜃爨孩表这载莽与PCR扩漤零裂懿PERV—TM彝PERV-SU基因连接，成功构建了原核表达载体pGEX

6、—TM和pGEX—SU。经ABl377謇动序歹1分牢厅投递雩亍全痔弼溺定，测定结桑显示其熬有正确鲍读蔼框。将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，应用IPTG对筛选出来的阳性熬组表越质粒进行诱导瀣达，并对表达的融合蛋白进行签定。／SDS-PAGE结果显示：PGEX-TM积PGEX。SU有外激蛋白的表达，但未见l、PGEX—el'IV的表达。蓖组PGEX．TM和PGEX。SU蛋自均为包涵体表达，利用摘要较优化的诱导表达条传，大量表达重缀融姆蛋白。烽缝化魄怠浸体进行复蛙后，选爝CM—SepharoseFastFlaw屡辑棱对羹组TM骚皇进行楚

7、纯。缝纯夔重缀PGEX．TM蟹骞经SDS—PAGE分辑，褥至l荤一蛋爨条带。剩羯缝仡静敲合爨自免疫大鼙白兔，蹋ELISA法捡溺蜀抗PERV抗体，效价为l：32000，掰表这静PGEX-TM融合蚤自作为包被抗源初步建立了简接ELISA法。绪聚，寝运的PGEX．TM蛋囱其有良好韵抗脲性和特异性，为从分子永平上对PGEX-TM臻白的功能住研究和发展PERV臻困212稷监测试剂奠定了基～础。0一；麓组PGEX-TM蛋白的成功表达将为下一步制备冀组蛋白的多克隆抗体作好充分的准餐。表达的PGEX—TM融会蛋白具有良好的抗原性和特异·

8、燮，为从分子水平上对P

9、GEX。，rM疆自的功§l性硬究和发I爱PERV纂医王理捻测渡刹葵定了纂础。关键溺：猪肉潦性爱转豢病毒；囊袋基戳：PERV-TM籀su沤基霾赞段；壳灌；序捌分新；蘸禽袭遮；多尧隆抗体沈阳农韭大掌硕士掌位论文英文缩写AmpAMV_RTBSA．cD_NA轻E擎CD醛S0DTTE．coliEDl’AELISAEnv戤Ip蕈GPAGEPCRPERvSDSSUTMX-gal英文缩略词表英文全称AmpicilIinAvianmyeloblastosisvirusreversetransenptaseBovinesel-Bl阻albuminComplemen

10、taryDNADiethylpyrocarbonateDimethylsulfoxideDithioththreitolEscherichiacoli中文垒称氨苄青霉素禽成髓细胞瘤瘸毒反转录酶牛照逶瞧蛋白互每}DNA焦炭酸二己繇二甲豢亚繇二硫苏糖醇大肠秆菌EthylenediaminetetraaceticacidzI二胺四乙酸Enzymelinkedimmunosorbentassay免疫吸附测定Envelopegene囊膜基因Horseradishperoxidase擐过裁饯甥酶Isopropylthio一13-D—galactoside异

11、器基藏干l：一8一》半戳精polyacrylamidegelelectrophoresis聚雨浠鬣胺凝胶嘏泳Polymerasechainreacti