人转录因子usf基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在fak启动子中的结合研究

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1、人转录因子USF基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在FAK启动子中的结合研究【摘要】目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子USF（upstreamstimulatoryfactor）并进行分离纯化，进一步分析其在FAK(focaladhesionkinase)启动子中的DNA结合能力。方法：将人源USFcDNA克隆到表达质粒pET28a载体，然后将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达带His6Tag的融合蛋白HisUSF，通过镍柱亲和层析纯化，SDSPAGE分析鉴定。EMSA分析纯化后的蛋白与FAK启动子的DNA结合情况

2、。结果：HisUSF在大肠杆菌中获得高效表达，镍柱亲和层析纯化得到了高纯度的蛋白，并能够结合到FAK的启动子上。结论：获得高效表达的高纯度HisUSF融合蛋白，为USF对其靶基因的结合与转录调控的进一步研究奠定了基础。【关键词】USF基因粘着斑激酶蛋白表达转录因子许多重要的细胞活动是由bHLH类型（basichelixloophelix）的转录因子所调控的,USF(upstreamstimulatoryfactor)就是这种类型的重要的转录因子。它含有helixloophelix结构域,以二聚化的形式结合到靶基因的调控区，调节基因的

3、转录[1]。它在靶基因上结合位点含有CACGTGEbox结构。USF最初是作为腺病毒晚期启动子的反式激活因子而被发现的[1]，后来的研究证明USF在组织中的分布很广泛[23]，许多的细胞基因也受到其调控[48]。受其调控的靶基因多是和细胞外基质、细胞生长、细胞增殖等相关的基因[47]及对压力刺激反应的基因[8]。USF在一些肿瘤中的表达水平明显异常[9]。为了研究USF在FAK(focaladhesionkinase)基因调控中的作用，我们首先用原核表达系统获得USF蛋白，并初步分析其在FAK基因启动子中的结合能力。1材料与方法1.1材

4、料pET28a、大肠杆菌Top10、BL21（DE3）由本实验室保存。含有人USFcDNA的质粒pRK5huUSF由PhilippePognonec赠送（InstituteofSignaling,DevelopmentalBiologyandCancerResearch,ParcValrose,06108Nicecedex2,France）。PCR试剂、限制性内切酶、T4连接酶、T4多聚核苷酸激酶等购自TaKaRa公司，IPTG购自华美生物公司，3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物科技有限公司，NiIDA填料购自Ph

5、amarcia公司，ProbeQuantTMG50微型离心柱购自安玛西亚，32PdATP购自北京福瑞公司。1.2方法1.2.1重组质粒的克隆首先，按照USF编码序列设计引物，USFcDNA扩增引物如下：USF上游引物（含EcoRI位点）5＇CCGGAATTCATGAAGGGGCAGCAGAAAACAGC3＇，USF下游引物（含HindⅢ）5＇GTCCCAAGCTTTTAGTTGCTGTCATTCTTGATGAC3＇，扩增的cDNA大小为933bp，USFcDNA编码310个氨基酸。PCR产物纯化回收后，经EcoRI和HindⅢ双酶切

6、，用T4连接酶连接到同样酶切回收的pET28a载体中，转化大肠杆菌Top10，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，经酶切鉴定后送上海英俊（Invitrogen）公司测序。1.2.2融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化将重组质粒pET28aUSF转化BL21（DE3）大肠杆菌，挑单克隆于1L有卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37℃摇菌培养，当其A260约达到0.8时，加入终浓度为1mmol·L-1IPTG，诱导35h，收获菌体，进行SDSPAGE分析。将表达菌体重悬于60mlBufferB（50mmol·L-1Na3PO4，300mmol·L-1Na

7、Cl，10mmol·L-1imidazole，pH8.0），超声破碎，离心取上清，NiIDA亲和层析柱由BufferB平衡过后上样,再用BufferC（50mmol·L-1Na3PO4，300mmol·L-1NaCl，50mmol·L-1imidazole，pH8.0）洗去杂蛋白，最后通过BufferD（50mmol·L-1Na3PO4，300mmol·L-1NaCl，250mmol·L-1imidazole，pH8.0）洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。1.2.3细胞核抽提根据文献[10]抽提3T3细胞核蛋白，PBS洗涤3T3细胞2次，然后用细胞刮

8、刮取细胞，重悬于Buffer1（10mmol·L-1HEPES,pH7.9,10mmol·L-1KCl,1.5mmol·L-1MgCl2,0.1mmo