犬瘟热病毒分离鉴定及其血凝蛋白区基因克隆测序分析

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1、贵州大学硕士学位论文犬瘟热病毒分离鉴定及其血凝蛋白区基因克隆测序分析姓名：张登祥申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：吴彤;李永明20030501英文缩写词表英文缩．写萸文个称巾文个称CDCaninedistemper犬瘟热CDVCaninedistcmnervirus犬瘟热病毒JAVCDVneIdisoIatefromjave¨na犬瘟热病毒野毒株SSVl5CDVisolatefromthangchundog犬瘟热病毒氏春犬株CAdV一1Canineadenovirustype_1犬腺病毒l型CEFChi

2、ckenembryonbroblast鸡胚成纤维细胞CPMCanineperitoneoscopemacrophage犬腹腔巨噬细胞Veromonkeykidney非洲绿猴肾细胞MDCKMadin-Darbycaninekidney狗肾细胞ELISAEnzyme—Hnkedimmunosorbenta鹳ay酶连免疫吸附测定法CPECyto帕thice仃ect细胞病变效应RT．PCRReversetra聪cripnonpolymerasecbainreacnon反转录一聚合酶链式反应PIDPostinocuIat

3、iⅫday(P9s“njectionday)接种后天数GZlCDVisofatefromGuizhouBomeipup犬瘟热病毒贵州分离株GZ2CDVi∞htcrromGuizhouBomcip¨p火瘟热病毒贵州分离株HAHemagglut抽ation血凝反应HHema职IH￡i-linpro￡e}n附着或瓶凝蛋自CAMChorio-n¨antoicmembrane鸡胚绒毛尿囊膜PTAPhosphotIlngsticAcid磷钨酸中文摘要犬瘟热(canjIltDistenlpel，cD)是当前对我国养犬业、毛皮

4、动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫炳，是一种急性、高度接触性传染病，传染性极强，发病率和死亡率极高，既可单独发病，又可继发其他细菌、病毒等的混合感染和_次感染。该病的病原犬瘟热病毒(can．11edistempervirIIs，cDv)是副粘病毒科麻疹病毒属成员，虽只有一个血清型，但毒株问毒力差异大。近几年来，随菥养犬业的发展．跨省和跨地区犬频繁引种，使得我省犬的传染病早_I二升趋势，其中cD在我省犬的传染病中首■其冲，造成了严重的经济损失。我省渗断cD的过去和现状，主要依靠体温计测景体温这一客观指标和诊断

5、者据怕床表现并结合流行病学作出印像诊断，未曾开展关于该病的病原学方面的实验研究。为此，小研究神：进彳_I=流彳：J=病学调伶、临床症状枪A用

6、j内罔!形态学观察的基础上．通过对自然发病犬虹清的ELIsA检测。肠内容物病料直接电镜观察及病毒的细胞分离培养，分别从2只波美幼犬的肠内容物中分离获得了2株对鸡及人“o”红血球均无凝集性的病毒．命名为Gzl和Gz2，填补了我省病原分离的空n。在此基础上，首次在我省利用分了生物学技术诊断cD。我们利用山长春中国人民解放军军需大学军事兽医研究所设计的cDv血凝蛋白(H)基冈的

7、I对特异性引物，对2株分离毒Gzl和Gz2基因进行了I玎．PcR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，得到与参考病毒JAv和ssvl5一致的特异性带，根据J，cRmarke"分子量参照物表型判断产物的电泳带大小为760bp左右，与设计理论值相符。至此，成功地将长春军事兽医研究所建立的liT．1’cR渗断cI'的方法廊用于我省cI)的诊断。另外，对Gz2株泳独进行r动物感染试验，以及其I，cRJ“物的克隆帚I测序，j1·将序列测定结果与GenbaIlk中发表的Io个cDv毒株的核苷酸序列进行比较和系统发生，同源性分析

8、，同时剥山序列测定结果推导的氨基艘序列进行了潜在糖基化位点、半胱氮酸残基、系统发生，同源性、亲水，疏水性和二级结构等分析。比较分析的结果表刿：t、在所比较的野毒中，我们分离的GZ2株与日本野毒FIN株H蛋自区核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性均最高，分别为97．4％和93．7％，而与中国长春Llu株的核苻酸序列同源性及月麦GRE株氨基酸序列同源性均最低，分别为94．2％和90．6％。2、标准弱毒疫苗株oND在核苷酸和氨基酸序列同源性上与野毒株问均表现为晟低值，从它们的系统发生树上可以将疫苗毒株与野毒株分成两组

9、，其中疫苗株自成l缀，野毒株组成第ll组，野毒株又可分为小同的谱系。3、在比较的氨基酸序列中，野毒株有4个潜在的糖基化位点，疫苗株仅有3个潜在的糖基化位点，其中的16~18位的氨基酸残基所形成的潜在的糖基化佛点是疫苗株没有而野毒株共有的，而月是完全保守的。4、Il个毒株的氨基酸序列中有4个半胱氨酸残基相对位置完全辅同，且编码这4个半胱氧酸～的密码予均为对应核苷酸序列上的TGT。这4个由