检测鼠粪中隐孢子虫卵囊方法的研究

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1、http://www.paper.edu.cn1检测鼠粪中隐孢子虫卵囊方法的研究*陈甫,黄克和(南京农业大学动物医学院，南京，210095)摘要：目的研究比较三种检测方法对鼠粪中微小隐孢子虫卵囊的检测效果，以便更好的为临床诊断服务。方法应用改良抗酸染色法(MAFS)、免疫荧光单克隆技术(IFA-McAb)检测法和PCR检测法分别对含有不同数量隐孢子虫卵囊的鼠粪样品、隐孢子虫病模型小鼠的鼠粪样品和某牛场的牛粪样品进行检测。结果MAFS检测法、IFA-McAb检测法和PCR检测法的检442测域值分别为10g鼠粪中含有

2、隐孢子虫卵囊2.0×10、2.0×10、2.0×10个，3种方法操作1次用的最短时间依次为35min、60min、3h。三者对实验鼠粪样品的检出率分别为65.0%、70.0%、85.0%，牛粪样品的检出率分别为21.21%、18.18%、27.27%，3种方法检出率之间差异不显著(P>0.05)。结论MAFS检测法简单、快速，花费较少，条件要求不高，特异性与IFA-McAb检测法相似，适合于对大量样品的检测和流行病学调查；IFA-McAb检测法、PCR检测法必须应用精密仪器，更适合隐孢子虫的鉴定；PCR检测法特异

3、性最强。关键词：微小隐孢子虫卵囊；免疫抑制；抗酸染色法；免疫荧光；单克隆抗体；PCR隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是细胞内寄生原虫——隐孢子虫(Cryptosporidium)引起的一种人畜共患传染病，现在被认为是人和动物腹泻的主要原因之一。自从1907年捷克著名寄生虫学家Tyzzer在小鼠粘膜组织中发现大量小鼠隐孢子虫(Cryptosporidiummuris)以来，关于[1]隐孢子虫感染的报道逐渐增多，1975年，Nime报道了首例人的隐孢子虫感染，许多脊椎动物、啮齿动物、禽类、两栖类、爬行

4、类动物和鱼感染的报道也逐渐增多，尤其是上世纪80年代初发现隐孢子虫与艾滋病有关后，日益受到各国学者的广泛重视。近年来，隐孢子虫病已严重危害人类和动物的健康，并造成了严重的经济损失,国内外儿童发病率的上升和健康人群及动物携带者数量的增多对隐孢子虫病的检测提出了更高的要求，因此，建立隐孢子虫病早期的实验室诊断技术具有重要意义。本文通过检测感染免疫抑制BALB/C小鼠模型和奶牛场采集的粪便样品中的微小隐孢子虫卵囊，研究了抗酸染色法、免疫荧光单克隆抗体技术与PCR检测法的检测效果，以便更好的为临床诊断服务。材料与方法1试

5、剂pH7.40.01mol/LPBS(NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.85g、NaH2PO4·2H2O0.2g、蒸馏水1000ml，溶解)；地塞米松磷酸钠注射液(武汉制药厂生产，批号：20050301)；单克隆抗体(本实验室研制保存)；异硫氢酸荧光素标记的羊抗鼠抗体(华美生物制品公司生产)；磷酸甘油缓冲液(90ml甘油加10ml0.01mol/LPBS混合)；TE配制：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)：称取0.120gTris加入80ml蒸馏水，用1mol/L的HCl

6、调至pH8.0；2%DTT消化液：取TE溶液10ml，加入0.2gDTT(二硫苏糖醇)配成2%的溶液。2检测样品的准备2.1梯度样品的准备65432将本实验室分离纯化的卵囊稀释成2.0×10、2.0×10、2.0×10、2.0×10、2.0×10、1基金项目：博士点基金资助项目（批准号：20030307022）作者简介：陈甫（1979－），男，博士研究生，E-mail：cf507@sohu.com。*通讯作者，黄克和（1958－），男，教授，博士生导师。E-mail：khhuang@njau.edu.cn。-1-

7、http://www.paper.edu.cn2.0×10个/ml的梯度，各取1ml加入到10g无寄生虫卵囊的新鲜鼠粪中，使每10g鼠粪中对65432应含有2.0×10、2.0×10、2.0×10、2.0×10、2.0×10、2.0×10个卵囊。2.2鼠粪样品的采集试验前彻底消毒饲养小鼠的器具和环境。20只BALB/C小鼠(6周龄，体重14～16g，雌性)，饲养适应3d，确定没有其他寄生虫感染后，进行以下试验。饮水中加入15μg/ml地塞[2-5]米松磷酸钠和40mg/L的庆大霉素注射液，自由饮用。免疫抑制5d后

8、，所有实验小鼠在5[2～6]第6d分别灌胃接种10个微小隐孢子虫卵囊。免疫抑制第8d起，逐日收集鼠粪至第27d，每天的粪便分别保存在2.5%的重铬酸钾溶液中。2.3牛粪样品的采集样品来自南京某奶牛场，按照大约5%的比例采集33头奶牛的新鲜粪便，编号。3隐孢子虫卵囊的检测将梯度浓度鼠粪、每天的模型鼠粪样品和33头牛粪样品均分为3份，每份10g，供以下3种方法检测。3.1MA