心肌肥厚相关的细胞色素b和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达的研究

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1、中国协和医科大学硕士学位论文心肌肥厚相关的细胞色素b和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达的研究姓名：刘俊明申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：陈兰英2002.10.1孛f，i枷和医样大学＆中屋蓬掌辩学院颤』-磷究生论文心肌肥厚相关的细胞色素b和线粒体肌酸激酶基因的克隆与表达的研究摘要随着医疗水平的提高，溶栓、冠脉搭桥等技术的提高和推广，中风、急性心援等疾病豹死亡率逐渐下降，在5年生存率提高的同时，心就肥厚、心寂等慢性心脏病患者的比例在增加。为更有效地防治和逆转心肌肥厚，减少心衰的发生，对心肌肥厚发生、发展机理的研究显得尤

2、为重要。从中心法则可知，基因是决定表型的关键所在，近年来，各种重大疾病相关基因的分离己成为揭示疾病发生机制的重要内容。分离心肌肥厚相关基因，并对其表达调控的研究，将为阐明其发病的分子机制，以及预防和治疗心肌肥厚提供有益的信息或线索。我们通过差减杂交分离压力负荷型心肌肥厚的相关基因的．获得了一些差异片段，并对其中的两个片段进行了进一步的研究。方法：本文选用腹主动脉绑扎(缩窄)的大鼠作为压力负荷型心肌肥厚的动物模型，运愿mR烈A反转录的eDNA的差减杂交，分离心飘肥厚发生过程中的相关基因；运用RACE对其中感兴趣的基因克隆其全长，并进行时

3、间和组织特异性表达分析。(1)采用常规的腹主动脉缩窄法(雄性健康Wistar大鼠，体重20％左右)建立压力负荷型左心室肥厚大鼠模型：对照鼠行假手术，即除不进行腹主动脉缩窄外其余手术过程同实验组。(2)在手术后1天、3天、术后4周提取左心室心肌组织RNA，反转录合成eDNA，经补平并加上合成接头，再经PCR扩增后进行4—5轮差减杂交；剩下的eDNA片段插入载体的多克隆位点后转化受体菌，筛选后建立差减文库；经菌落原位杂交，挑选出其中杂交信号有差异的克隆子；最后对其中的部分克隆子进行序列测定和同源性比较。(3)对其中一一个片段30,的序列分

4、析发现，其与细胞色素b(cytb)脱鞲基蛋白有很高的同源性，另～个片段18—3与线粒体肌酸激酶(MitochondrialCreatineKinase，mt·CK)有很高的同源性，因而对它们进行了迸～步的研摘要中Ⅲ髀和医科火学＆中嗣跃弓。科学院颤±列}究生论文究。以SMARTRACE，刑它们进行了全长基因的扩增、克隆和测序。(4)利用Northem杂交，比较了cytb幂umt—CK基因在负荷4周后的几种组织中的表达，并对它们神：左，11,中不同时

5、百j点I天、3天、4周、8周的表达进行了研究。(5)INcytb与辅酶q结合并与线粒体功

6、能相关，为此本文用高效液相色谱(HPLC)进行了左室一tl,肌线粒体中辅酶Q9含量的测定。(6)采用SouthemEpid,杂交进行了左室心肌中线粒体DNA拷贝数相对含量的测定。(7)用比色法测定了左室心肌中SOD的活力。(8)以Western印记杂交检测了左室心肌中线粒体肌酸激酶的蛋白含量。结果：(1)模型的建立：①术后3天、4周和8周后实验组和对照组颈动脉平均压(mmHg)分别为：82．2±9．1vs88．3±11．3，ns；108．9±8．7vs86．9±6．6，p<0．01；109．7±8．1vs84．4±5．8，p<0．01

7、，n=6。②术后4周和8周后实验组和对照组的细胞面积(um2)分别为301．2±32．2vs240．7±19．9，p<0．01；335．7±23，0vs263．7±11．4，p<0．0l，rt=6。(2)在三个不同时期的心肌组织中分离出二十四个差异片段。(3)首次克隆了大鼠细胞色素b脱辅基蛋白的全长cDNA序列，共1172nt，编码380个氨基酸，已被GenBank接收，序列号为AF295545，同时克隆了全长mt—CKeDNA基因，长1449nt。(以上(2)、(3)部分工作主要由潘德思和李健博士完成)(4)在负荷4周后的大鼠心、肝

8、、脑、骨骼肌和肾等组织中，eytb基因均有表达，与GAPDH相比较，其比值按心、肾、脑、骨骼肌和肝脏依次降低．以心脏组织中表达最高；在左心中，不同时间表达的研究发现cytb在第3天实验组表达显著升高(2．35+0．26vs1．98+0．24，p<0．05)，在4周表达降低(1．52±0．19vs2．04+0．16，p<0．01)，而在第1天和8周实验组与对照组无统计学差异。在负荷4周后的大鼠所研究豹组织中，mt-CK基因仅在心肌和骨骼肌中表达；在左心中，不同时间表达的研究发现lilt—CK基因在绑扎第3天组显著高于对照组(O．936±

9、O，207vsO．486±O．12)，而在4周和8周回落到与对照相当的水平。(5)压力负荷3天和4周时，心肌线粒体CoQ9含量(gedmgMitpr)明显增高。分别为55+2．26vs45，5±1．83，p<0．05和3