基因工程制备hITF及其对肠粘膜保护作用的研究

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1、上海交通大学2003N博士学位论文Y，98170G基因工程制各hlTF及其对肠粘膜保护作用的研究H1GHLlCVELlcXJ)RESSIONOFRECoMBlNANTHUMANINTESⅡNALTREFoILR～CToRINPICHIAPASToRISANDIrllSPRoTECTIoNAGAINSTINTESTINALMUCoSAL研究生姓名研究生学号DAMAGE刘伟103062指导教师许春娣教授导师组成员陈舜年教授学科专业儿科学消化专业申请学位级别博士学位论文提交日期2006年5月培养单位上海交通大学医学院附属瑞金医院

2、本课题得到上海市科委2003年基础项目重大课题的资助。编号：03Jcl4041lg['／．-I：人小肠三叶因子，重组hlTF，毕赤酵母，发酵表达，肠粘膜，损伤修复巾文摘要基因工程制备hITF及其对肠粘膜保护作用的研究摘要腹泻病是儿科临床医疗的常见病和多发病。目前该病的治疗手段只能部分减轻患者腹泻的症状，不能及时修复肠道粘膜，从而使部分患儿腹泻迁延甚至转为慢性，导致严重的营养不良，生长障碍或丧失劳动力。胃肠粘膜的早期修复有助于限制液体流动、电解质丢失，以及防止胃肠道腔内的外部抗原弥散入局部或全身而引起免疫反应。但是肠道粘膜损

3、伤后早期修复的机制仍不清楚。小肠三叶因子(intestinaltrefoilfactor，ITF)是由59个氨基酸残基组成的具有特定三叶结构域的多肽，主要由肠道粘膜分泌表达，在消化道腔内TTF能保持结构及功能上的完整。由于ITF在组织中的含量很低，通过组织提取非常困难。因此，我们利用基因工程技术获得人小肠三叶因子(humanh]testinaltrefoilfactor，hITF)，并对其保护肠粘膜的作用进行了研究。在构建了含AOXI启动子和n分泌信号肽序列的毕赤酵母重组表达质粒pPIC9／hITF的基础上，将重组质粒电转

4、化入酵母感受态细胞中，筛选出符合要求的转化予；应用5L发酵罐，采用廉价的基本盐培养基大规模发酵表达目的蛋白，收集发酵液上清过柱纯化后，应用质谱技术和蛋白免疫印迹技术鉴定所得蛋白质的性质和免疫原性，同时对重组蛋白的生物学活性进行了鉴定，实验结果均肯定了重组蛋白与组织提取蛋白无结构和功能上的差异。应用大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEc一6)观察不同浓度重组hlTF对肠上皮细胞形态、增殖和迁移功能的影响，在细胞生物学水平研究了hITF保护肠粘膜的作用。采用TNBS／乙醇制备大鼠肠粘膜损伤模型，并在造模前和造模后不同时间给予实验动物重组

5、hlTF，观察不同浓度hITF在整体水平对肠粘膜的预防性保护作用以及促进肠粘膜损伤后修复的作用。在5L发酵罐中获得发酵液约3．5L，上清液约2．5L，总纯化得率为3j一45％，共获得目的蛋白250mg，纯度>96％，蛋白表达水平为73．33mg／L。体外实验结果表明，在10一～10。浓度范围内重组hITF能够促进肠上皮细胞的迁移，但是对肠上皮细胞的光镜一卜形态和肠，h皮细胞的增殖功能影响不显著。整体水平实验结果显示，在肠粘膜损伤之前或之后给予不同浓度的外源性hlTF的实验组，大鼠肠粘膜损伤程度明显较对照组轻，大体损伤评分和

6、病理组织学评分均明显低于对照组，而且实验组的髓过氧化物酶活性也明显低于对照组。表明hITF既有对肠粘膜受损的预防性保护作用，又有促进肠粘膜损伤后修复的作用。本实验为大规模：[业化生产重组h!TF奠定了基础，同时对hITF促进肠粘膜修复的作用和细胞生物学机制进行了探讨。关键词人小肠三叶因子，重组hITF，毕赤酵母，发酵表达，肠粘膜，损伤修复IIABSTRACTHIGHLEVELEXPRESS10N0FRECOMBINANTHUMANINTESTnqALTREFOILFACTORINPICHIAPASTORISANDITSPR

7、OTECTIoNAGAINST日、『TESTINALMUCOSALDAMAGEDiarrheadiseasewasacommonandevenfrequently—occurringdiseaseinpediatrics．However,mostofthepresenttherapeuticmeasurescouldonlypartiallyalleviatesymptomsandleavetheinjuredintestinalmucousunrepaired，whichledtotherapydelayorevenwo

8、rsentochronicdisease，togetherwithseveredystrophy,growthretardationorlossoflaborabilities．Theearlyrepairofintestinalmucosalinjuriescontributedtorestricti