利多卡因对成年大鼠海马CA1区锥体细胞L型Ca2单通道特性的影响

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1、第一军医大学硕士学位论文利多卡因对成年大鼠海马CA<,1>区锥体细胞L-型Ca<'2+>单通道特性的影响姓名：张庆国申请学位级别：硕士专业：临床麻醉学指导教师：徐世元20030527利多卡因对成年大鼠海马CAl区锥体细胞L．型Ca2+单通道特性的影响研究生张庆国导师徐世元教授(第一军医大学珠江医院麻醉科广州510282)中文摘要一、目的：局麻药系临床麻醉最为常用的药物，其所致中枢神经系统(CNS)毒性惊厥为临床上常见的并发症，但目前对局麻药惊厥的发生机制尚无满意的解释。本实验研究的目的是运用膜片钳技术

2、(patchclamDtechnique，PCT)的细胞贴附模式(Cell—attached)记录方法，从单通道水平研究不同浓度利多卡因对成年大鼠海马CAl区锥体细胞上L．型Ca”通道活动的影响，以探讨局麻药毒性惊厥的中枢分子机理，进而为临床预防和救治局麻药中毒惊厥提供实验依据。二、方法：(一)采用酶加机械分离的方法，急性分离出成年大鼠海马CA．区锥体细胞。大鼠麻醉后迅速断头取脑，置入用纯02饱和的低温(0。C--4。C)低钙缓冲液中，用振动切片机切成400gm厚的冠状脑片，将脑片置于孵育液中，通95

3、％02—5％C02混合气体孵育l～6h。取出脑片于低钙缓冲液中分离出海马CAl区，切成lI砌2的小片，置于1～1．59／L的链霉蛋白酶液中酶解30～45min。酶解后的脑片用低钙缓冲液清洗三遍，移入装有2ml低钙缓冲液的试管中，用三根尖端经火抛光的Pasteur吸管梯度吹打使细胞游离。吹打好的细胞悬液静置3min，吸取中层滴加于盖玻片上，粘附10～15min。倒掉未粘附上的组织碎片和细胞，将盖玻片放入加有1～2“浴槽液的记录浴槽中即可进行离子通道记录。(二)采用膜片钳技术的细胞贴附记录模式进行离子通道

4、记录。汇录采用细胞贴附(Cell—attached)记录模式，微电极用电极拉制器拉制，入水电阻为6～9MQ，封接电阻大于5GQ。放大器反馈电阻设置为50GD，低通滤波频率为lkHz，采样频率5kHz，间隔5s。用去极化脉冲对ca2+通道进行激活，用pCLAMP(version8．0，AxonInstruments)Clampex程序进行数据采集，用Fetchan和pSTAT对离子通道进行分析。首先鉴定和观察海马神经元上L一型ca”通道的基本电生理学和药理学特性。利多卡因经微量加样器依次加入浴槽液中，浓

5、度逐次累加形成6个终浓度(0、2、4、8、16、32Ixg／m1)，记录不同浓度下利多卡因对L一型ca”单通道活动的影响，资料存入硬盘以备分析和进行统计处弹。三、结果：(一)分离出的成年大鼠海马CAl区锥体细胞形态学特征保存完好，符合实验条件的细胞游离、呈锥形、活性好、贴壁好，整个细胞胞膜清晰、胞体透亮、胞浆均匀一致并保存有较长的轴突、树突，轴突可长达200um以上。活性细胞还保存了L．型Ca2+通道的基本电生理学和药理学特性，易于鉴别。(二)低浓度利多卡因(2、4“∥戚)对L．型Ca2+通道的活动无

6、明显影响；浓度达8、16“g／rm时，L一型Ca2+通道平均开放时间由对照6．10±0．25ms分别增加到8．12±0．30ms(P<0．05)、7．71±0．54ms(P<0．05)，浓度达32“g／ml时，开放时间反而降至4．89±0．22ms(P<0．05)；浓度为8、16、32I．tg／ml时，整体平均电流分别为0．804±0．092pA(P

7、放概率增加(P<0．05)，随着浓度的进一步增加(32肛g／m1)，开放概率又逐渐减小(P<0．05)。总体．4。而言，随着浓度的增加利多卡因对L一型Ca2+通道的影响表现为先兴奋后抑制的作用。四、结论：(一)成功地建立了一种简单、快速、可靠的适用于膜片钳单通道记录的成年大鼠海马CA．区锥体细胞的急性分离方法。分离出的海马锥体细胞不仅形态学特征保存完好，并且运用PCT的细胞贴附模式鉴定并记录了L一型ca2+通道的单通道电活动情况，观察了Nifedipine和BayK8644对通道电活动的影响，其结果与

8、相关文献报道的基本一致，(二)利多卡因对成年大鼠海马CAl区锥体细胞L．型Ca2+单通道活动的影响呈浓度依赖性的特点：较低浓度时(2、4I_tg／m1)无明显影响；当增加到一定浓度时(8、16ktg／m1)，表现出显著的兴奋性作用；当浓度进一步增加到32p∥ml时，则表现为明显的抑制作用。实验结果表明高浓度利多卡因引起的CNS功能变化与L．型Ca2+通道功能活动的变化有关。提示L一型ca”通道功能活动的变化可能与局麻药的中枢神经毒性机制有关。关键词：大鼠