新颖醛缩酶的发现及其催化性质的研究

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1、密级：硕士学位论文作者姓名：蓝益指导教师：筮塾蛆啦虽≤自签型堂2生国拦瞳醚垫型造拖趁逝呦黻别：薹瞪攀m眦：丝避蟒撇；主垦拦瞳登缸笾生毖坳逝二零一三年四月一等一二：牛比冒月IIllllllllllUlllllfllllll[HfllllllfY2381450NovelAldolasesADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofEngineeringByLeiHan(ChemicalEngineeri

2、ng)DissertationSupervisor：ProfessorDunmingZhuTianjinInstituteofIndustrialBiotechnologyApril，2013独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。作者签名：磊慨川；¨心日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解史国科堂陵云鎏王些生堑撞丕妥塞压有关保留、使用学位论文的规定，有

3、权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权虫垦型堂陵云洼王些生塑堇盔婴塞压可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意中国科学院天津工业生物技术研究所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。作者签名：导师签名：日期：)-o，j年支月>口日日期：歹驴I；年支月)-o日致谢本论文是在朱敦明研究员和吴洽庆研究员的悉心指导和关怀下完成的。从论文的开题、研究方向的确立、文章的撰写到实验室及日常的生活，无不倾注了两位老师的巨大心血。他们实事求是的科研作风、渊博而系统

4、的知识体系、严谨认真的治学态度、和蔼谦虚的人格魅力将使我受益终生。对两位老师的感激之情无言以表。本论文的撰写过程中，也得到了冯进辉老师、陈曦老师的的大力关心和指导，他们年轻有为，思路清晰开阔，对工作认真负责，令我受益匪浅。同时，感谢本实验室的张大龙老师、刘卫东老师、董文碉老师、任杰老师，袁京老师、李建煲老师、刘祥涛老师、王玉老师、姚培元老师、张瑞老师、高秀珍师姐、卜丹丹老师、李广悦师兄、姜进举师兄、段毅涛师兄、生措师姐、牛可钦师兄、周传华同学、陈杰同学、李倩同学、张红榴同学、田来强同学、李哲同学、熊鑫师弟、杨贝贝师妹、迟靖师妹、郭倩师妹、张海灵师妹、张凤禹师妹、丛培乾师妹对我的科研、生活

5、等各方面的的关怀和帮助。感谢亲朋好友，正是因为你们的一路支持和陪伴，我才能走到今天。特别要感谢我的父母和爷爷奶奶，你们对我的养育之恩难以言表。在此，我要向所有爱我的人和我爱的人、关心我的人和我关心的人、鼓励我的人和批评我的人致以最崇高的敬意和由衷的感谢!韩磊2013年4月摘要碳一碳键的形成反应是有机合成化学的基石，醛缩酶不但是实现这一反应的重要工具，而且还能在温和条件下高效地、立体选择性地催化碳一碳键的形成并产生一个或两个新的手性中心。尽管如此，他们在应用上仍存在着一些问题：底物谱窄、在反应条件下易失活、复杂的缩合产物纯化过程等。这些问题一直是醛缩酶大规模应用的主要瓶颈。然而，酶催化技术

6、在化学品绿色制造中的应用基础是发现高效的酶。因此，本课题定位于发现具有宽底物谱、高稳定性、高活性的新型醛缩酶，以便应用于手性药物前体的合成。脱氧核糖磷酸醛缩酶(DERA，EC4．1．2．4)是目前发现的唯一一种乙醛依赖型的醛缩酶。在有机合成应用中，己报道的DERA都存在着一些缺陷：可溶表达量低、对高浓度乙醛的稳定性差、活力低等。本课题利用了一套合理的基因挖掘手段在数据库中发现了一种来自StaphylococcusaureusN315的潜在DERA(SaDERA)，将其基因的密码子进行优化后实现了在大肠杆菌中的过量表达，研究了纯化后的SaDERA的催化性质。结果表明，构建的工程菌具有较高的

7、可溶表达量(占总蛋白的70％)，通过简单的一步纯化即可得到电泳纯的酶；它是一种同源二聚体的酶(57kDa)，其最适反应条件是pH7．7和450C；它具有良好的碱耐受性：在pH11．0、25。C下温浴24h，仍有93％的相对活力；它具有良好的乙醛耐受性：在0．3mol／L乙醛浓度、25。C下，30min内保持了高于70％的相对活力；乙醛自缩合产物被纯化并鉴定，所得产品为两次连续自缩合产物。总之，SaDERA的一些特性使其具有一定的应用