EMT转录因子Twist1在肝癌血管生成拟太形成中差异microRNA的筛选

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1、分类号：R370．2密级：学位类别：科学学位团专业学位口0学校代码：学号：学科门类：l0622010602097医学又肄眚科史垮硕士学位论文IⅥLASTER’SDISSERTATIoN论文题目：EMT转录因子Twistl在肝癌血管生成拟态形成中差异microRNA的筛选TITLETheScreenoftheDiverseMicroRNAwithintheEMTTranscriptionFactorTwistlInducedVasculogenicMimicryinHCC一级学科：基础医学二级学科：病理学与病理生理学论文作者：崔中水指导教师：孙保存教授导师组成员：赵楠讲师天

2、津医科大学研究生院二0一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：蕉曼整日期：弘p年F月，27日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国

3、家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囹。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：日期：的13年广朝日日期：劢J3年铲翩日天津医科人学硕十学位论文中文摘要背景与目的：miRNA(microRNA)是一些长度很短的非编码RNA，通过降低靶基因的稳定性或抑制其翻译水平来影响细胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表明miRNA对于肿瘤形成起到重要作用。关于其在VM发生发展中所起的作用，已经同益成为研究的热点，本课题采用博奥公司miRNA基因芯片检测肝细胞肝癌HepG2过表达Twistl后差异表达的miRNA

4、基因，并采用实时定量PCR验证芯片结果的准确性；通过生物信息学分析差异miRNA的作用靶点，筛选出VM相关miRNA，并探讨其在VM形成中发挥作用的可能机制。该研究结果为探明miRNA在Twistl调控EMT进而促进VM形成过程中发挥其调控作用的具体机制提供理论指导和实验依据。方法：本研究将人肝癌细胞株HepG2作为细胞研究对象，通过构建Twistl表达质粒并转染HepG2细胞获得过表达Twistl的肝癌细胞模型，以未转染的HepG2细胞作为对照，分别提取RNA，在此基础上利用博奥公司的miRNA芯片对其进行实验分析过表达Twistl可引发的miRNA表达谱变化，建立mi

5、RNA基因表达谱，找出明显上调或下调的基因进行分析。从中选取表达差异最明显的上调的hsa-miR-128及下调的has．miR一27a、has—miR一26b、has—miR一17，采用实时定量PCR技术进一步验证芯片的结果，并用U6作为内参。芯片检测结果数据由上海其明公司结合生物信息学方法利用TargetScan数据库查询miRNA的靶基因，通过筛选已报道与VM相关的靶基因找出可能在VM形成过程中具有调控作用的miRNA。结果：1．在HepG2细胞过表达Twistl的肝癌细胞模型中查出差异表达有统计学意义的18个miRNA：其中上调的miRNA基因5个：has．miR一

6、128、has-miR．132、has-miR-151．5p、has．miR-26a、has．miR．3195；下调的miRNA基因13个：has-miR·25、has—miR一12461has—miR一19a、has—miR一378，has-miR-486—3p、has—miR一140—3p、has-miR-26b、has—miR一27a、has-miR一19b、has．miR-1260b、has—miR一23b、has-miR一17、has—miR．9。2．miRNA的实时定量PCR验证结果显示：has—miR．27a、has．miR一26b、大津医科人学硕士学位论文

7、has—miR．17在HepG2一Twistl细胞中相对低表达，而has．miR．128在HepG2．Twistl细胞中相对高表达，与芯片结果基本吻合。3．生物信息学预测到的靶基因情况：miRNA靶基因个数不尽相同，有数百种甚至上千种：在众多靶基因中筛选出与VM相关的Ⅶ一cadherin、EphA2、MMP2和VEGF—A等靶基因以及对应的miRNA(has．miR．27a、has．miR．26b和has．miR一17)。结论：1．HepG2细胞过表达Twistl后有18种miRNA发生明显的表达变化，其中包括5种上调表达：h