紫菜叶状体遗传分析与PEPCK、PEPC在不同世代间的表达分析

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1、HeLinwenADissertationSubmittedtoUniVersityofChineseAcademyofSciencesInpartialfum¨mentoftherequirementForthedegreeofDoctorofMarinebioIogyInstituteofoceanology'ChineseAcademyofSciencesApr¨2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，

2、均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任人由本人承担。论文作者签名：彳寸林火日期：Ⅺ忙∑．、L学位论文版权使用授权书本人完全了解中国科学院海洋研究所有关保留、使用学位论文的规定，同意海洋研究所保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国科学院海洋研究所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。(保密论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签字：何翻良日期：N1．譬．、、．导师签字日期：跏似￡纩致谢本论文是在导师王广策研究员的悉心指导下完成的，从实验的设计、开展到文章的

3、撰写和发表，王老师都给予了耐心的指导。王老师勤奋认真的工作态度、严谨的治学态度使我深受感染，并将终身受益。五年来，王老师不仅在学习上给予指导帮助，并且在生活上给予关心帮助，使我能够克服学习和生活中的困难，在此对我的导师表示衷心的感谢。感谢本实验室的张宝玉、牛建峰、林阿朋、彭光和刘海航老师，感谢开放实验室的邓涪和邓田老师，感谢研究生部的各位老师，他们的帮助使我的论文能够顺利完成。同时感谢常熟理工学院的许璞教授和朱建一教授以及天津科技大学的潘光华、才金玲、朱大玲和刘洪艳老师。感谢实验室的师兄师姐范晓蕾、乔洪金、吕芳、陈张帆、王超、周伟，同学张晓娟、郝彬、黄小峰、李荣锋、李明杰、冯兴如、徐

4、腾飞、郭文静、宋厉芸、黎近兴，师弟师妹黄爱优、郇丽、顾文辉、赵佩佩、高山、谢修俊、靳皓琛、杨芳、杨睿灵、周文琴、徐美玲、贾兆君、吴晓杰、刘凯、赵宇鹏、纪长绵、侯兆君、王文磊、崔淘淘等在实验上和生活上的关心和帮助，在此向他们表示感谢!感谢我的爷爷、奶奶、父母以及所有家人的关心和鼓励，是他们一直在默默的支持我，在我遇到困难时给我帮助和支持，使我能够全心的在这里学习。最后对所有给予我帮助和支持的人表示衷心的感谢!摘要紫菜是重要的经济海藻，其生活史包括单倍的叶状体世代和双倍的丝状体世代。与高等植物不同的是，其孢子体世代为微观阶段，配子体世代为宏观阶段。紫菜的减数分裂发生在壳孢子萌发时期，分裂

5、产生的四个细胞不分开，共同发育为一株紫菜，也就是说紫菜的叶状体是嵌合体。在使用嵌合的叶状体进行遗传分析时可能得到不准确的结果。另外，紫菜的叶状体固着生长于潮间带的石块上，随着潮水的涨落经历脱水和复水过程；而紫菜的丝状体钻入贝壳等碳酸钙基质中生长，不能脱离海水生存。这两个世代生活环境的差异可能导致其光合特性的不同。为此本文进行了如下研究：1)以条斑紫菜为材料，利用AFLP标记对单个丝状藻丝接种贝壳释放出的壳孢子发育来的叶状体和由随机选择的壳孢子苗释放出的单孢子苗分别进行遗传分析。15对引物组合在40个壳孢子苗中扩增得到538个位点，其中多态性位点为434个，多态性比率为80．7％。对4

6、0个个体进行遗传相似性分析发现其遗传相似性系数最大为0．93，最小为0．47，平均为O．71。19对引物组合在88个单孢子苗中扩增得到708个位点，其中多态性位点为698个，多态性比率为98．6％。对88个个体进行遗传相似性分析发现其遗传相似性系数最大为0．78，最小为O．43，平均为O．61。聚类分析发现壳孢子苗和单孢子苗个体均可分为明显的两大类。结果表明，单孢子苗中检测到的多态性比率高于壳孢子苗，单孢子苗个体间的相似性低于壳孢子苗个体间的相似性，因此使用单孢子苗进行遗传分析获得的结果比使用壳孢子苗更准确。2)以坛紫菜丝状体(丝状藻丝)和叶状体为材料，以18S和GAPDH为内参基因

7、，使用荧光定量PCR技术对PEPCK、PEPC在不同世代的差异进行分析；利用酶偶联法分别测定了叶状体和丝状体中PEPc、PEPCK羧化和脱羧的活性；利用PEPCK、PEPC的保守区序列，使用PMAL表达系统对其进行原核表达，并对蛋白表达温度及所需IPTG浓度进行优化，纯化并浓缩得到的蛋白，制备相应蛋白的抗体，利用得到的抗体分析叶状体和丝状体中PEPCK、PEPC含量的差异。结果表明，丝状体中的PEPCK、PEPC的mRNA含量、酶活以及蛋白含量均高于叶状体