纳米载体介导抑制大鼠肝脏MyD88基因表达的实验研究

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1、分类号：R735．3密级：学位类别：科学学位团专业学位口学校代码：1062学号：2010602249学科门类：医学又坪眚科袁辱硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：纳米载体介导抑制大鼠肝脏MyD88基因表达的实验研究TITLETheResearchonInhibitingMyD88GeneExpressioninLiverofRatMediatedbyNanometerVector一级学科：临床医学二级学科：外科学普外论文作者：宋鹏指导教师：刘彤教授导师组成员：刘刚副主任医师天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明艘㈣本人郑重声明：所呈交的论文是我

2、个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签学位论文版权使用授权书日期；矿f辞5月?p日本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密口，在——年解密后适用本授权书。不保密[五／o

3、(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签导师签名：——日期：2．c，lJ年多月弓D日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：观察纳米载体介导I斟A干扰对大鼠肝脏免疫识别相关基INMyD88表达的体内抑制效果并筛选相对高效shRNA质粒载体。方法：设计合成针对MyD88mRNA序列特异。I生MyD88shRNA3条，并分别构建于Pgenesil．1质粒，提取重组质粒进行酶切鉴定并测序。构建新型阳离子聚合物组氨酸接枝聚(p一氨基酯)为基因载体，对其和其与pHK的复合物进行表征。通过载shRNA质粒与纳米阳离子聚合物耦合实验，确定两者最佳结合比。经门静脉注射方法转染大鼠肝脏观察转染效果，

4、设置生理盐水对照组、单纯纳米载体组和纳米．pHK组，采取转染后第l天和第3天肝脏标本和下腔静脉血，应用全波长酶标仪检测方法评价体内肝脏转染效果，全自动血生化分析仪检测肝肾功能变化。采用上述转染方法筛选3条特异。[_生MyD88shRNA，设置生理盐水对照组、单纯纳米载体组、纳米一pHK载体阴性对照组和3个纳米载MyD88．shRNA质粒干预组，取转染术后第3天肝脏，荧光定量PCR检测肝脏转染后MyD88mRNA的表达水平的变化，WesternBlot技术检测转染后MyD88蛋白表达水平的变化。使用SPSS17．0forWindows进行数据分析。结果：经测序结果分析，pMyD881一

5、shRNA、pMyD882一shRNA、pMyD883一shRNA均为插入正确的克隆质粒。纳米阳离子聚合物理化性能稳定、安全、低毒，载shRNA质粒和纳米阳离子聚合物耦合形成纳米载体的最佳结合质量比为l：80。第1天和第3天纳米．pHK组的增强型绿荧光蛋I刍(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)荧光强度均显著强于生理盐水对照组和单纯纳米载体组(P

6、(P>O．05)；荧光实时定量PCR检测显示3个pMyD88．shRNA质粒通过纳米载体转染大鼠肝脏，均能不同程度地抑制MyD88的表达，与对照组具有显著差异(P<0．01)，其qUpMyD88．shRNAl质粒组的抑制作用最为明显；WesternBlot检测显示3个纳米MyD88．shRNA质粒组中肝脏转染后MyD88蛋白的表达水平均较对照组明显降低(P<0．01)，与对照组有显著性差异，其中pMyD88．shRNAl质粒组抑制蛋白表达作用最为明显。结论：纳米阳离子聚合物制备简便、安全低毒，免疫原性低；以纳米载体为介导经门静脉注射纳米质粒复合物的方法可使shRNA质粒在体内肝脏获得

7、高效转奎望堕型奎堂堡主堂篁笙茎染且对肝肾功能损害较小；应用成功构建的MyD88．shRNA质粒载体体内转染大鼠肝脏，可显著抑制肝脏的MyD88基因表达，而其中pMyD88一s11IⅢA1质粒抑制效率更高，可进一步用于动物实验。关键词：RNA干扰质粒纳米载体MyD88II天津医科大学硕士学位论文Abstract_Objective：ToinvestigatetheinhibitingeffectsofnanometervectorcontainingshRN