大鼠肝脏干细胞的分离、培养及肝刺激因子对其增殖的研究

《大鼠肝脏干细胞的分离、培养及肝刺激因子对其增殖的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、首都医科大学硕士研究生毕业论文中文摘要大鼠肝脏干细胞的分离、培养及肝刺激因子对其增殖的研究中文摘要干细胞(stemcell)的研究是近年来细胞生物学领域的热门课题。传统概念认为干细胞应定义为:具有增殖能力，并能产生大量后裔的未分化细胞，干细胞只存在于增殖旺盛的组织，如骨髓，上皮，这些组织一旦受到损害，可通过干细胞增殖和分化，完成组织再生(tissueregeneration)。但是，随着对干细胞研究的深入，人们发现许多组织中都存在干细胞，如胰腺、神经和肝脏等。目前己有大量证据表明，成年动物和人肝脏中存在具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双潜能肝脏干细胞。啮齿类细胞

2、移植实验也表明，干细胞在肝脏中可分化为肝细胞，使因毒物损害而造成结构与功能破坏的肝脏得以重建。此外，研究还发现，干细胞的增生在一定的病理条件下能引发肝脏的恶性病变。肝脏干细胞的两种不同演变结果是如何被调控的呢?体外干细胞的基因改造是否可行呢?另有文献报导，在哺乳动物新生肝及再生肝胞质中存在一种热稳定性蛋白，分子量介于14-20kD，命名为肝刺激因子(HepaticStimulatorSubstance,HSS)。研究证实，HSS抗酸、耐碱，可特异性刺激肝细胞或肝源性肿瘤细胞系DNA合成。但是，首都医科大学硕士研究生毕业it3C一一一一一一一一上z里HSS对肝干细

3、胞的作用尚不得而知。因此，肝脏干细胞的分离、纯化、培养即成为了揭开诸多迷团的基础。鉴此，本实验拟用0.06%3’一甲基一二甲氨基偶氮苯(3'-methyl-dimethylaminoazobenzene,3'-Me-DAB)喂养的SD大鼠为模型，分别用Percoll密度梯度离心法及分步消化法分离肝脏干细胞，具体步骤为:1.肝脏干细胞的分离首先，建立肝脏干细胞增生模型。用0.06%3'-Me-DAB喂养SD大鼠4周，处死后取部分肝脏组织，经固定、包埋、切片、HE染色，发现大鼠肝中可见大量呈团索状的小细胞，主要集中在胆小管附近，细胞体积较小，核/质比例较大。然后用此

4、模型鼠分离肝脏干细胞。肝原位灌流用药4周的大鼠，分离单个细胞。用Percoll密度梯度离心法及分步消化法分离出两种干细胞，分别为卵圆细胞(ovalcell,OVC)和小圆干细胞(smallroundstemcell,SRSC)。经鉴定它们的存活率分别为90%和92%.2.肝脏干细胞的培养两种细胞的生长特点、细胞形态有很大差异。卵圆细胞第1代生长缓慢，培养第2天时，可见很少量上皮状细胞贴壁生长，核为卵圆形。核仁小而清楚，胞浆较少。接种后10天呈克隆状生首都医科大学硕士研究生毕业论文一一一一rp鱼长，似铺路石。此时，可观察到少量杂细胞，通过不间断的镜下观察，用刮刀纯

5、化细胞。当细胞铺满瓶壁时，传代。此种细胞性状很均一，目前己传到28代，与以前相比无明显变化。用常规方法消化并半量换液。小圆干细胞第1代为半悬浮状，呈现大小不均一的圆形。其分化速度非常快，第二天就可见大量贴壁细胞，形状极不均一。3.干细胞鉴定迄今为止，还没有发现肝脏干细胞的特异性标志物。角蛋白19(CK19)是公认的胆管细胞标志物，而甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)是公认的肝细胞标志物。因此，我们选用这3个指标作为肝脏干细胞的标准。我们用细胞免疫组化染色法，以人抗鼠CK19单抗，兔抗鼠ALB单抗及羊抗鼠AFP多抗对两种细胞鉴定。其中小圆干细胞鉴定第1代细胞。结

6、果表明，这两种细胞CK19,ALB均为阳性，说明它们具有双向分化的潜能，确为干细胞。而小圆干细胞AFP也为阳性，提示小圆干细胞是较为早期的干细胞。4.小圆干细胞分化以1%的DMSO作用第一代小圆干细胞12天，通过形态学及细胞化学染色发现，与对照组相比，大量小圆干细胞可向OVC首都医科大学硕士研究生毕业论文中文摘要移形。说明DMSO有诱导分化作用，OVC可能是小圆干细胞的子代。5.HSS对卵圆细胞的作用体外加入重组HSS，利用MTT法及流式细胞仪检测培养的卵圆细胞，发现以160--400ng/ml浓度作用于卵圆细胞，可抑制细胞增殖。但不呈现剂量一效应关系。卵圆细胞

7、在240ng/ml的重组HSS作用下抑制作用达到高峰。流式细胞仪分析结果表明，以240ng/ml重组HSS作用12小时，S期细胞比例较对照细胞降低28.9%。鉴于前人的大量研究，推测HSS可能是通过STAT3(signaltransducerandactivatoroftranscription3)途径，在抑制细胞生长的同时，促进其分化。综上，本实验分离、培养出两种表型不同的肝脏干细胞一卵圆细胞和小圆干细胞并观察HSS对卵圆细胞的作用，为进一步研究肝脏干细胞的体外增殖、定向分化提供实验数据。首都医科大学硕士研究生毕业论文英文摘要Isolation,culture

8、ofliverstemc