耳叶牛皮消颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠p53及PCNA蛋白表达的影响

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1、耳叶牛皮消颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠p53及PCNA蛋白表达的影响作者：何行玲，彭传芬，黄祖明，郭莲军【摘要】　　目的观察耳叶牛皮消颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎（CAG）大鼠p53基因及增生细胞核抗原（PCNA）表达的影响。方法采用热盐水灌胃方法制作CAG动物模型，以不同剂量的耳叶牛皮消颗粒进行治疗后，用免疫组化法检测大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白的表达。结果经过热盐水灌胃造模后，大鼠胃黏膜腺体萎缩。以耳叶牛皮消颗粒治疗后，大鼠胃黏膜腺体萎缩明显减轻，胃黏膜细胞p53阳性表达率和PCNA标记指数显著降低。结论耳叶牛皮消颗粒治疗CAG的机制可能是通过抑制突变型p53基因及PCNA蛋白的表达，从而恢复

2、细胞增殖与凋亡的平衡来实现的。【关键词】耳叶牛皮消颗粒；慢性萎缩性胃炎；p53；PCNA　　慢性萎缩性胃炎（CAG）是消化系统疾病治疗中的难点之一，属于癌前病变，对人类健康威胁较大。耳叶牛皮消CynanchumauriculatumRoyleex6Wight为萝藦科鹅绒藤属植物，是广泛分布于四川、湖北等地的常用草药，具有养阴补虚、健脾消食之功效。笔者经研究发现，耳叶牛皮消能明显提高小鼠的小肠推进功能［1］。进一步以耳叶牛皮消、黄连、枳实、白术、三七等中药制成耳叶牛皮消颗粒，并观察了其对CAG大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白表达的影响。现报告如下。　　1材料　　1.1动物清洁级SD大鼠，体质量（2

3、00±20）g，♂，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供（动物生产许可证号：医动字第19-025号）。　　1.2药物与试剂耳叶牛皮消颗粒由本院制剂室制备，批号：20070819，处方组成为耳叶牛皮消、黄连、枳实、党参、白术、茯苓、三七、白芍、法半夏、甘草、干姜，临用时用蒸馏水配制成合适浓度的混悬液。抗p53单克隆抗体(DO-1)，由北京中山生物技术有限公司提供；PCNA单克隆抗体和LSAB试剂盒，由DAKO公司(日本)生产。　　2方法　　2.1模型制作及给药方法　　取健康SD大鼠110只，随机分为5组，每组22只，即正常组、模型组和耳叶牛皮消高、中、低剂量组。除正常组外，其余各组均采用热盐

4、水灌胃方法制作CAG动物模型［2］。即用55℃6的15%氯化钠溶液灌胃，1次/d，每次2.5ml，共12周。实验开始，先处死5只正常组大鼠，并留取胃大体标本作为对照，以后各组每2周处死2只大鼠，取胃标本进行病理检查，以观察胃黏膜萎缩情况，判断造模是否成功。从第13周开始灌服药物治疗，至第24周末结束。其中耳叶牛皮消高、中、低剂量组分别予耳叶牛皮消颗粒相当于原生药5，2.5和1.25g·kg-1·d-1灌胃，正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃。　　2.2检测指标及方法　　各组实验结束将大鼠断头处死后剖腹取全胃，沿大弯剖开，生理盐水漂洗摊平作大体观察，沿胃小弯条状取材。胃黏膜标本经10%甲醛液固定，石

5、蜡包埋切片。免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(S-P)，按试剂盒内说明书操作。阳性对照为已知阳性组织切片在同一条件下反应，阴性对照以正常兔血清代替第一抗体。结果判断标准参考文献［3］。p53结果按如下方法进行评分：①阳性着色程度：无着色为0，浅着色为1，深着色为2；②阳性着色范围：无着色为0，着色小于1/3为1，着色大于1/3为2，弥漫性着色为3。然后将以上两项评分相加，结果大于或等于三者为阳性病例。PCNA结果用PCNA标记指数（LI）表示：LI=PCNA阳性细胞数/计数细胞总数×100%。在高倍镜下选取5个有代表性的视野，每个视野记数100个细胞，计算PCNA阳性细胞表达率。

6、6　　2.3数据处理　　采用t检验和χ2检验，SAS统计软件计算机处理。　　3结果　　p53阳性着色位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，各切片显色分布不均，以片状和局灶性为主，少数为弥漫性分布。见图1。PCNA阳性着色位于细胞核，呈棕黄色细颗粒状。见图2。CAG模型大鼠在给予耳叶牛皮消颗粒治疗后，p53阳性表达率和PCNALI明显降低。其中耳叶牛皮消高、中剂量组p53阳性表达率明显低于模型组（P<0.05），耳叶牛皮消各剂量组PCNALI显著低于模型组(P<0.01或P<0.05)。见表1。表1各组大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白的表达比较（略）　　4讨论6　　正常胃黏膜细胞的增生与凋

7、亡维持着细胞总数的平衡，这种平衡的失调在CAG到胃癌的发展过程中起重要作用。细胞凋亡受众多基因调控，其中p53基因是与人类肿瘤发生相关性最高的突变基因，位于17号染色体短臂上，对细胞的生长有重要的调节作用。野生型p53基因能阻止具有癌变倾向的突变细胞出现，但它很容易转变成突变型p53基因而丧失调节功能，导致细胞恶性增生［4］。野生型p53基因表达的蛋白半衰期甚短，一般检测方法难以检出，而当基因发生