天花粉蛋白基因重组及其生物学活性研究

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1、摘要1.采用聚合酶链式反应方法(PCR),K}舌楼(TrichosanthinKirilowiiMaximowicz)基因组DNA为模板，设计、合成两对的寡聚核着酸为引物，扩增出两DNA片段:一个为编码成熟夭花粉蛋白的DNA片段(0.741kb称gene2)另一个包含gene2和编码23个氮基酸组成的分泌型信号肤及19个氛基酸组成的狡基端延伸因子的DNA片段(0.867kb称genel).将genel和gene2分别克隆到载体PUC18上，序列分析与己报道的序列比较其同源性达，9.3%,Westeinblot

2、-ting检阿证明gene2在E.coli中能表达夭花粉蛋白genel则不能.原因在进一步研究之中.2.两个夭花粉蛋白基因一一一个编码成熟天花粉蛋白另一个编码含狡基端19个氨基酸在内的夭花粉蛋白被重组到高效表达载体pGEX"KG并获高效表达，其表达量分别占细胞总蛋白的31%和51%.利用glutathioneagarose亲和层析方法和位点特异性蛋白酶(thromain),两种天花粉蛋白被成功地从其融合蛋白中纯化出来.通常情况下100m1细菌培养物可获2.5mg左右纯化的夭花粉蛋白.本研究为夭花粉蛋白的结构改

3、造和功能研究莫定了基础.3.对夭然和已纯化的两种重组天花粉蛋白进行生物学活性的比较研究表明，两重组天花粉蛋白显微注射都能抑制孕酮诱导的非州爪蛤(Xenopuslaevis)卵母细胞胚泡破裂(germinalvesiclebreakdown)有效剂量为10师9.两种重组天花粉蛋白都能切割双链超螺旋DNA为线状和缺口环状.在一定剂量下切割效率随时间延长而增强.但是两种重组天花粉蛋白对小鼠止孕和流产活性不如夭然天花粉蛋白强。本研究首次发现，天然和重组夭花粉蛋白对染色体具切割效应.能切出与内切醉带相似的带纹.在对其靶

4、细胞一胎盘绒毛膜上皮癌细胞的作用中，我们还发现重组与天然天花粉蛋白一样能诱导染色体断裂成为1个或数个核小体.在DNA凝胶电泳上由可见200bpxn的DNAladder，同时还观察到染色质凝集和核固缩等观察.表明天花粉可以诱导绒瘩细胞产生调亡(apoptosis)或程序性细胞死亡(pro-grammedcelldeath)。2一4.-定浓度的天花粉蛋白(25ug/ml)处理体外培养的胎盘绒毛膜上皮癌细胞、结果表明天花粉蛋白对绒癌细胞生长具明显的抑制作用.加药24hr天花粉蛋白在绒癌细胞中主要沿细胞核膜一侧以“新

5、月形’冠状分布，而在Hela细胞中则以不规则弥敬形分布.与此同时.绒癌细胞增殖受到抑制、细胞数量不增加或增加很少.流式细胞光度术分析表明。加药24hrG2/M期细胞明显减少。72hr后加药和不加药组GZ/M期细胞都减少并以加药组更为明显，且伴随S期细胞增多.分别提取经夭花粉处理24hr,72h:的绒瘩细胞DNA.总RNA并以同样处理的Hela细胞为对照，进行DNA末端标记电泳分析和RNA斑点杂交，结果表明，24hr时，经天花粉蛋白处理的绒癌细胞DNA断裂，出现调亡细胞特征性的‘DNAladder'而Hela细

6、胞则无。此时癌荃因C-myc,PKC二及p53变化不明显.72hr加药和不加药的绒癌、Hela细胞均出现调亡特征性的DNAladder':同时加药组C-myc出现高表达，PKC:及p53表达变化亦不明显.ABSTRACTStudyontheTriehosanthin(TCS)generecombinantandItsbiologicalactivities1.AccordingtothereportedTCSgeneSequence,twopairsofprimerforspecificTCSgeneampl

7、ifeationhavebeendesignedandsynthesizedasfollows:genel:3'-primer:5'-CTACTAA-ATAGCA丁CAC丁丁CCACA-3'5'-primer:5'-ATGATCAG-ATTCTTAGTCCTC-3'gene2:3'-primer:5'-CTACT-ATGCCATATTGTTTCGATT-5'5'-primer:5'-ATGGATGTT-AGCTTCCGTTTA-3'UsingDNAPolymeraseChainReaction(PCR)met

8、hod,fourDNAfragmentshavebeenamplifiedwithTCSgenomicDNAastemplateanddifferentcombinationofthetwopairsofsyntheticoligonucleotidesasprimers.Theyareasfollows:Ogene]:5'-primer+3'-primer`gene2:5'-primer+3'-p