小麦紫黄质脱环氧化酶基因的克隆及其表达研究

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1、山东农业大学博士学位论文小麦紫黄质脱环氧化酶基因的克隆及其表达研究姓名：李滨申请学位级别：博士专业：植物学指导教师：邹琦2003.6.1关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有

2、关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：彪彬导师签名：日期：山东农业大学博士学位论文摘要植物光合机构中叶绿体色素吸收的光能通过光化学过程转化为稳定的化学能。然而，大多数情况下植物接受的能量要超过其所能转化的能量，如果过量的光能不及时耗散掉，些盒垫毖会降低，导致光合作用的光抑制，甚至出现光氧化、光破坏。依赖于叶黄素循环(Xanthophyllcycle)／拘热耗散作用近年来受到普遍的关注。它在耗散过剩激发能、保护光合机构中起着主要的作用，被认为是光保护的主要

3、途径。叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时，双环氧的紫黄质(v)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下，经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(z)；在暗处，则在玉米黄质环氧化酶(zE)的作用下朝相反的方向进行，将z重新环氧化为V。形成一个循环。关于叶黄素循环在防御光抑制和光破坏中的作用已成为光合作用研究的一个热点领域。本研究欲根据已知植物的紫黄质脱环氧化酶基因序列从小麦叶片中克隆该基因，并利用根癌农杆菌介导法将其反义基因导入烟草中，研究其在烟草植株内的功能表达，为VDE基因工程提供基因资源和理论依据。，fRT--PCR法

4、得到小麦紫黄质脱环氧化酶(WVDE)的全系列，cDNA的全长为1,746bp。L其ORF长度为1,365bp，编码454个氨基酸，分子量为39．8KD，其中转运肽长度为106个氨基酸，成熟蛋白348氨基酸。GenBank注册号为AF265294。W'VDEeDNA的编码区序列与水稻、拟南芥、烟草、莴苣、菠菜和茶树的同源性分别为78．7％、62．6％、58．3％、60．8％、60．6％和61．2％。小麦叶片在晴天情况下的PSII最大光化学效率(Fv／Fm)在上午随光强的增加而呈迅速下降，中午12：00达到最低点，表明发生光抑制。与此同时

5、，非光化学猝灭(NPQ)迅速上升，在中午12：00达到最高值，光化学效率变化趋势相反。强光和弱光下叶黄素循环脱环氧化状态存在明显的差异。RT-PCTsouthern检测结果表明，小麦叶片中的W'VDE的表达与反映过剩光能热耗散的NPQ值有很好的线性关系。选用pBll21载体系统，将W'VDE的5’端反向插入到载体中。利用根癌农杆菌介导法转化烟草。经过近60天左右的培养，共获得烟草再生植株80余株。Southern杂交和RT-PCR检测结果，可以断定目的基因已经整合到转基因烟草的基因组中。躲李滨：小麦紫黄质脱环氧化酶的克隆及其表达研究转

6、基因烟草与对照植株在强光处理的初期和早晨照光时间较短、光强较弱时的Fv／Fm和NPQ无较大的差别，但随着照光时间的延长和光强的增加两者的Fv／Fm值的下降和NPQ值的升高开始呈现较大的差异。盐胁迫中转基因烟草与对照的Fv／Fm和NPQ的变化也有相似的结果，胁迫初期两者的Fv／Fm的下降几乎相同，但随着处理时间的增加，转基因株迅速降低，而对照则保持缓慢下降的趋势。44C低温处理中转基因烟草与对照的Fv原m在开始的前3h中下降幅度基本一致，而3h之后转基因株表现出Fv／Fm的急剧降低，但置于弱光下48h后转基因植株的Fv／Fm可以恢复到与

7、对照相同的初始值。研究表明转反义WVDE基因植株抑制了烟草VDE的活性，导致热耗散能力下降。逆境条件下，植物的碳同化过程受到抑制，导致光能更加过剩，，在此情况下抑制／VDE，光抑制加重。说明WVDE在过剩光能耗散中起重要作用。y关键词：小舅叶黄亲磊环紫黄质雇≤氧化酶光瘭螽生查查些盔堂堡主兰堡堕苎——————————————————一ABS．rRAcTTheradiantenergyabsorbedbythephotosyntheticapparatuswillfinallybepartiallyconvenedimosteadyche

8、micalenergyviaphotochemicalprocesses．Whenplantsabsorbmoreli叠ht也anthatcanbeusedforphotosynthesis，theeXCeSSenerg