参芪复方对GK大鼠胰岛β细胞凋亡和诱导型一氧化氮合酶表达的影响

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1、参芪复方对GK大鼠胰岛β细胞凋亡和诱导型一氧化氮合酶表达的影响【摘要】　　目的观察参芪复方对自发性2型糖尿病动物GK大鼠（Goto-Kakizakiwisterrats）胰岛β细胞凋亡的影响及其可能机制。方法选取4月龄SPF级雄性GK大鼠50只，随机分为模型组、盐酸二甲双胍组、参芪复方低、高剂量组并另设正常Wister大鼠对照组。连续灌药4周后，TUNEL染色观察各组胰岛β细胞凋亡指数（AI），并采用免疫组化染色，Mias-2000图像分析系统观察各组大鼠胰岛β细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性物质积

2、分光密度。结果模型及低剂量组β细胞AI较正常组显著增高（P<0.01），各治疗组AI显著低于模型组（P<0.01），高剂量及二甲双胍组β细胞AI显著降于低剂量组（P<0.01）且与正常组比较无统计学意义（P＞0.05）；模型及低剂量组胰岛iNOS阳性物质积分光密度显著高于正常组（P<0.01），高剂量组、二甲双胍组iNOS积分光密度显著低于模型组（P<0.05），与正常组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论参芪复方能够抑制GK大鼠胰岛β细胞凋亡，机制可能与其抑制β细胞iNO

3、S表达有关。【关键词】参芪复方GK大鼠β细胞诱导型一氧化氮合酶凋亡9　　参芪复方主要由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄等组成，具有益气养阴、清热生津，活血化淤的功效。以往研究显示，参芪复方具有抗2型糖尿病（T2DM）早期动脉粥样硬化、低度炎症的作用［1,2］，但其对胰岛β细胞凋亡的影响未见报道。本研究观察了参芪复方对自发性2型糖尿病动物模型GK大鼠胰岛β细胞凋亡的影响并初步探讨了其可能机制。　　1器材　　1.1动物4月龄雄性SPF级自发性2型糖尿病GK大鼠50只及正常Wistar大鼠1

4、6只（中国科学院上海实验动物中心提供），按2～3只/笼饲养于独立通气笼具（IVC）系统内。　　1.2药品与试剂参芪复方浸膏粉（1g浸膏粉相当于原生药10g，四川大学华西药学院药厂提供，批号20031008），盐酸二甲双胍片（天津太平洋制药有限公司，批号：20040523），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（博士德公司），诱导型一氧化氮合酶（iNOS）一抗、即用型SABC试剂盒（博士德公司）。　　1.3仪器Mias-2000图象分析系统（四川大学智胜软件股份有限公司），OLYMPUSBX50型光学显微镜（日本O

5、LYMPUS公司）等。　　2方法9　　2.1分组方法GK大鼠适应性饲养1周后，尾静脉取血测随机血糖，随机血糖≤11.1mmol/L者共6只剔除［3］，余44只按血糖由高到低排列编号依据随机分为模型组、二甲双胍组、中药低剂量组、中药高剂量组，另设普通Wistar大鼠正常对照组，每组11只。各组均喂饲普通饲料。　　2.2给药方法正常对照组和模型组予生理盐水5ml/（kg·d）灌服；二甲双胍组予盐酸二甲双胍125.0mg/（kg·d），中药低、高剂量组分别予参芪复方0.5，2.0g/（kg·d），共28d。　　

6、2.3观察指标及检测方法　　2.3.1β细胞凋亡计数大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，应用TUNEL法染凋亡细胞，试剂盒购于博士德公司，操作按试剂盒说明进行。光镜下观察凋亡细胞核呈紫蓝色，胞浆呈棕黄色颗粒。每例切片计数10个400倍视野的凋亡细胞数，然后按公式计算细胞凋亡指数（AI）。AI（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。　　2.3.2胰岛iNOS表达大鼠处死后立即取鼠胰腺组织，FFA液（甲醛醋酸酒精固定液）固定后，石蜡包埋，滚动式切片机纵切成4μ9m薄片，将切片置于经防脱片剂处理后的载玻片上，使切片紧密

7、黏附，常规脱蜡至水化，余参照即用型SABC免疫组化试剂盒说明书染色。用OLYMPUSBX50光学显微镜观察染色结果，胞浆棕染为阳性，每张切片选3个胰岛，输入Mias-2000图像分析系统，在200×镜下分别测量胰岛细胞iNOS阳性物质积分光密度并计算其均值。　　2.4统计方法用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD，方差不齐采用Tamhanecs'T2统计方法。　　3结果　　3.1一般状况实验过程中模型组3只大鼠、低剂量组和二甲双胍组各1只大鼠

8、死亡。其余各组大鼠无死亡。　　3.2参芪复方对各组大鼠胰岛β细胞凋亡指数的影响见表1。模型组及低剂量组较正常组凋亡指数显著增高（P<0.01），高剂量组及二甲双胍组凋亡指数虽较正常组升高，但差异无显著性(P>0.05)；各治疗组凋亡指数较模型组显著降低（P<0.01）；高剂量组及二甲双胍组凋亡指数较低剂量组显著降低（P<0.01）。　　表1参芪复方对各组大鼠胰岛凋亡指数影响比较（略）　　与正常组比较，＃