血卟啉单甲醚作为光敏剂对卵巢癌细胞的体外光动力杀伤作用

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1、山东大学硕士学位论文血卟啉单甲醚作为光敏剂对卵巢癌细胞的体外光动力杀伤作用姓名：魏永青申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：孔北华20070510原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：瓿求喃关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关

2、部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：趣垒盘导师签名：2垒丝蟹山东大学硕士学位论文血卟啉单甲醚作为光敏剂对卵巢癌细胞的体外光动力杀伤作用研究生：魏永青专业：妇产科学导师：孔北华中文摘要【研究背景与目的】卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，因缺乏特异性症状和有效的早期诊断手段，多数患者确诊时已是晚期。随着科研和临床的发展应用，卵巢癌治疗方法不断完善

3、，但手术和化疗这些传统的治疗手段均未能显著改善晚期患者长期生存率，绝大多数的晚期卵巢癌患者最终将复发并死于癌症。对于晚期和复发性卵巢恶性肿瘤，延长患者寿命和提高患者生存质量是治疗的主要原则。而手术与化疗作为主要治疗手段，其治疗价值尚未得到肯定。光动力学治疗(photodynamictherapy，PDT)是20世纪新兴的一种肿瘤治疗方式，它是一种将光敏剂(Ps)和特定波长的激发光源结合起来，从而产生光毒性作用的肿瘤治疗方法。因其具有非侵入性、选择性高、副作用小而成为肿瘤治疗的新热点。现在临床上已广泛用于良性血管增生性疾病的治疗，对于

4、一些恶性肿瘤如表皮的鳞状细胞和基底细胞癌、头面部肿瘤、肺癌、膀胱癌等的治疗也取得了良好的效果。光动力治疗通过局部或系统给药，然后对靶器官进行光照，引发生物学效应。对于晚期或复发性卵巢癌患者的光动力治疗可采取腹腔内照射的方式，即在给予光敏剂后，通过开腹或腹腔镜的形式将光源导入腹腔，对术后残存的微小病灶进行弥漫性照射，或者对大的孤立性病灶行局部照射，也称为腹腔光动力学治疗(intrapcritonncalphotodynamictherapy，IPPDT)，该方法有望成为晚期或复发性卵巢癌患者新的治疗手段。血卟啉单甲醚(HMME)是国产

5、第二代光敏剂，具有成分单一，靶向性强等特点。大量的lf每床基础研究表明血卟啉单甲醚是一种有临床应用前景的光敏剂。我们前期的研究发现它对卵巢上皮性恶性肿瘤细胞及荷瘤鼠模型具有较强抑瘤作用，诱导卵巢癌细胞的死亡方式以坏死为主。本研究中，我们通过降低光敏剂的使用剂量，研究PDT诱导的细胞调亡现象，并结合高剂量的光敏剂的光动力杀伤作用研究HMME—PDT杀伤方式的剂量依赖性，并通过结合线粒体、溶酶体探针研究光敏剂山东大学硕士学位论文在细胞内的定位，及测定调亡相关基因的表达来探讨血卟啉单甲醚对卵巢癌细胞杀伤的分子机制。【材料与方法】卵巢癌细胞

6、3AO与光敏剂(HMME，3／Hg／mL或者30,ug／mL)、亚细胞器探针(RHl23，10∥咖蜮hcif打Yellow，12099／mL)共同孵育后，取不同时间点在荧光显微镜下以特定激发波长激发光敏剂与荧光探针，观察光敏剂的细胞内定位。3#g／mL或者30／l‘g／mL两种不同浓度的HMME—PDT后细胞活力仪测定细胞的死亡率，流式细胞仪分析细胞死亡形式，线粒体相关调亡检测试剂盒及Rodaminel23(RHl23)染色检测线粒体破坏情况，探讨细胞凋亡途径。DAPI荧光染色观察细胞形态学变化。【结果】HMME在卵巢癌3AO细胞内

7、呈现红色荧光，RHl23、LuciferYellow单独染色后细胞浆内均可见绿色点状荧光；低浓度的HMME与RHl23共同孵育后1h，可见细胞内黄色颗粒状共同染色区域，高浓度的HMME与RHl23共同孵育后30m，可见细胞内黄色颗粒状共同染色区域；低浓度HMME与LuciferYellow共同孵育后细胞内3h始见黄色颗粒状共同染色区域，而高浓度HMME与LuciferYellow共同孵育后细胞内1h可见黄色颗粒状共同染色区域。表明HMME在细胞线粒体和溶酶体上都有分布，只是在细胞器中蓄积的速度不尽相同，光敏剂进入线粒体的时间较早，蓄

8、积速度较快。单纯激光照射，无论光照强度大小对细胞存活率均无影响(P>O．05)；单纯光敏剂(HMME)作用于细胞，无论药物剂量大小(O～3叽g／mL)细胞生存率亦不受影响(P>0．05)。高、低两种不同浓度(劬g／mL或3毗咖L)的H