发展一种新的LAMP技术快速检测石斑鱼虹彩病毒SGIV

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1、发展一种新的LAMP技术快速检测石斑鱼虹彩病毒(SGIV)摘要舞未雅聪彩病黛S炙GIV轰彗筢种热煮熊核酸扩增检本研究针对晤斑鱼虹彩病毒()建立了一种薪的环介导的等温核酸扩增检测技术(100p-mediatedisothermalamplification．LAMP)。针对开放读码框014L设计了包括环引物在内的6条特异性引物组，同时构建了SGIVORF-014L核酸序列的重组质粒pT加14L作为检测阳性模板。结果显示，在聚合酶BstDNApolymerasclagefragment作用下，反应温度65℃(恒温)、反应时间60mins为最佳LAMP扩增条件，

2、通过条带分子量大小和限制性内切酶MstI对产物进行进一步鉴定：另外，4引物组和6引物组对阳性模板的最早检出时间相差一倍，分别是40rain和20min。运用三种LAMP扩增结果判定方法(核酸的琼脂糖凝胶电泳、SYBRGreenI荧光染料直接对产物进行染色和肉跟直接观测副产物焦磷酸镁沉淀)检测SGIV,检测极限在6～660个拷贝之间：与巢式PCR相比，LAMP检铡的灵敏度高3个数量级。在相同条件下，通过对SGIV及其他7种不同相关度的DNA、RNA病毒进行LAMP扩增，显示了本研究设计的引物组及LAMP技术具有高度的种间特异性。在细胞、组织层面，分别用SGI

3、V感染敏感细胞系GP和石斑鱼，在感染后细胞、组织中检测到SGIV病毒，未攻毒细胞及健康鱼组织中则未发现该病毒；LAMP与PCR检测结果一致：对攻毒后的不同鱼组织DNA进行LAMP扩增，发现石斑鱼脾、肾感染SGIV严重，肝、肠也有SGlV感染，情况稍弱，未发现脑部感染，LAMP扩增与PCR检测结果保持一致。LAMP技术对SGIVORF-014L的时效表达进行监测，发现在SGIV感染GP细胞6h后，可以检测到该基因在细胞内转录及表达，48h时达最大值。本研究结果表明。LAMP检测技术具有简便、快速、灵敏等优点，可以为水产养殖业提供现场的实验室检测和诊断：LAM

4、P技术还可用于检测特定基因的时效转录表达。关键词：石斑鱼虹彩病毒；LAMP；巢式PCR中山大学硕士学位论文AmpASFVⅪP刑BHVSBmBlvBLASTbpBSAB3CallPVdd}120DIl肇E．coliEBVEDl'AEHNVFBSFPVF口FV3F3HHVlHSV6缩略词ampicillin，氨苄青霉素Africanswinefevervires，非洲猪瘟病毒adenodine5'-triphophate，腺苷三磷酸Ambystomatigrinumvirus，虎纹钝口螺病毒Bovineherpesvirus5．牛疱疹病毒5Backinnerp

5、rimer反向内引物Bohleiridovirus，饰纹汀蛙虹彩病毒BasicLocalAlignmentSearchToolbasepair,碱基对bovine女l"umalbumin，牛血清白蛋白反向外引物Canarypoxvirus，金丝雀痘病毒doubledistilledwater,双蒸水deoxynucleosldelrlphosphnte，脱氧核苷三磷酸Eseherichiacoil，大肠杆菌Epstein-Banvirus。EB病毒ethylenediaminetetmaeeticacid，乙二胺四乙酸Epizootichaematopoi

6、eticnecrosisvirus，流行性造血器官坏死病毒fetalbovine$enllu，胎牛血清Fowlpoxvirus，禽痘病毒Forwardinnerprimer正向内引物Frogvirus3，蛀病毒3正向外引物Humanhefpesvimsl，人疱疹病毒1Herpessimplexvirus6，单纯疱疹病毒6V——生些查堂堡主兰丝笙苎HSV7Heq，cssimplexvires7，单纯疱疹病毒7IPTGisoprophylthio-b-D-galacu)side，异丙基硫代．b．D．半乳糖苷IHNVinfectioushacma幻poictic

7、necrosisvims传染性造血器官坏死病毒ISKNVInfectioussp

8、ccnandkidneynega)sisvims，传染性脾肾坏死病毒Kankanamycln，卡那霉素KHVKoiherpesvirus，鲤春疱疹病毒LAMPloop-mediatedisothermalamplification环介导的等温核酸扩增LCDVFishlymphocystisdiseasevirus，鱼淋巴囊肿病毒LBBackloopprimer反向环引物LFForwardloopprimer正向环引物NestedPCRNestedpolymerasechain

9、macron，巢式多聚酶链式反应NNVnen，olJsnccJ∞i