沙门菌属stn基因lamp快速检测方法的研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyonLAMPMethodofstnGeneforRapidDetectionofSalmonellaByAihuaLiSupervisor：Prof．DongchunQinDepartmentofPathogenicBiologyBasicMedicineCollegeofZhengzhouUniversitySeptember,2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经

2、注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期≯脾学位论文使用授权声明绍日本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论

3、文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日摘要沙门菌属stn基因LAMP快速检测方法的建立及应用硕士学位申请人：李爱华推荐导师：秦东春教授郑州大学基础医学院病原生物学教研室河南郑州450052摘要沙门菌是对人类和动物健康都能构成危害的一类致病菌，据世界卫生组织报道，白二十世纪末以来，沙门菌对人类健康的威胁越来越大，己引起全球卫生组织的重视。近年来，随着进出口贸易日益繁荣，也使得沙门菌的全球性传播成为可能，致使口岸出入境样本检测工作量急剧增加；而各口岸出入境工作人员结构组成复杂，流动快，难以控制，因此建立快

4、速、准确、简便的检测方法保证进出口的安全性迫在眉睫。本研究目的：拟以沙门菌肠毒素基因(Salmonellaenterotoxingene，stn)作为靶基因，建立检测沙门菌的DNA环介导的恒温扩增法((100p—mediatedisothermalamplificationofDNA，LAMP)，对沙门菌属进行特异性检测，建立切实可行的快速沙门菌检测技术并初步应用。方法：1．在GenBank数据库中检索沙门菌属stn基因核苷酸序列，提交到PrimerExplorerV4设计相应的LAMP引物，并通过Oligo6．0进行分析，以确保引物之间无二聚体形成；应用BLAST

5、程序，通过GenBank对引物及扩增产物进行同源性对比，经筛选获得特异性内外引物各一对。2．利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，使目的基因高效扩增。3．对LAMP反应体系和反应条件进行优化，在反应体系中添加SYBR．GreenI荧光染料，结合显色反应，使结果观察直观准确，能真正实现现场快速简便检测。4．用沙门氏菌标准株和非沙门氏菌标准株检测方法的特异性和敏感性。与摘要表型检测方法显色培养基法同时检测肉、蛋、奶、水产品等样品共计100份，检测该方法的实用性。结果：1．本研究建立的以沙门菌stn基因LAMP快速检测方法，LAMP反应体积259

6、l，在最佳扩增温度63℃恒温条件下，时间60rain内完成对沙门氏菌的检测。2．检测沙门氏菌DNA最低浓度极值为1fg／ml，检测沙门氏菌菌液最低浓度极值为10cfu／ml。对沙门氏菌株阳性检出率100％，非沙门氏菌株检测均为阴性。3．100份检验、检疫样品检测结果与表型检测方法显色培养基检测结果对比，一致率100％。结论：本研究建立了沙门菌属stn基因LAMP检测方法，并应用于沙门菌属标准株检测及疑污染沙门菌的检验检疫样品检测中，结果表明该法敏感性、特异性高，简便快速，不需要昂贵的仪器设备，操作简单，不易出现DNA污染。加入荧光染料显色后，结果更易于观察。确实能达

7、到快速检测沙门菌的目的，是一种适合口岸及基层检验、检疫部门使用的沙门氏菌快速检测方法。关键词：沙门菌；沙门菌肠毒素基因；环介导等温扩增技术；快速检测IIAbstractStudyonLAMPMethodofstnGeneforRapidDetectionofSalmonellaPostgraduate：AihuaLiSupervisor：Prof．DongchunQinDepartmentofPathogenicBiologyBasicMedicineCollegeofZhengzhouUniversityZhengzhouHenan450052Salmonel