鸡矢藤挥发油体外抗乙型肝炎病毒作用研究

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1、鸡矢藤挥发油体外抗乙型肝炎病毒作用研究作者：朱宁，黄迪南，侯敢，葛庆华　【摘要】目的对鸡矢藤挥发油抗HBV作用进行体外抗病毒实验研究。方法采用水蒸气蒸馏法提取鸡矢藤挥发油，以HepG2.2.15细胞为实验对象，检测鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15肝癌细胞株的细胞毒性。并在最大无毒浓度下观察鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞表达HBsAg，HBeAg的影响。结果鸡矢藤挥发油在31～2000mg/L的浓度范围内，对HepG2.2.15细胞有明显抑制作用，TC50为1550mg/L,TC0为500mg/L。在最大无毒浓度

2、下，鸡矢藤挥发油对HBsAg最大抑制率为72.49%，治疗指数为6.74，对HBeAg最大抑制率为23.64%。结论鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞HBsAg，HBeAg分泌有较好抑制作用。【关键词】鸡矢藤;乙型肝炎病毒;HepG2.2.15细胞株;挥发油;乙肝表面抗原;乙肝e抗原　鸡矢藤是茜草科(Rubiaceae)鸡矢藤属(Paederia)多年生蔓性草质藤本植物鸡矢藤Paederscandens(Lour.)9Merri.的全株，其味甘酸，平和，是一种常用中草药[1]，广泛分布于中国、日本、韩国、越南、泰国、

3、菲律宾、印度等，以及美国西海岸。传统中药经验表明其在黄疸、肝炎、肝脾肿大等治疗方面具有一定的作用[2，3]，其作为一种有效的抗乙肝辅助性草药，在中药中配伍很广;同时其嫩茎叶又是广东;海南一带居民喜欢吃的美味野菜[4]，具有很高的食用安全性。本实验中对鸡矢藤挥发油抗HBV作用进行了体外抗病毒的实验研究，以期为鸡矢藤的进一步开发提供理论依据。　　1材料　　1.1鸡矢藤药粉鸡矢藤地上部分采集于广东湛江市郊，经广东医学院生化教研室黄迪南教授鉴定，为鸡矢藤Paederiascandens(Lour.)Merr。阴干，中药粉碎机粉碎

4、并过60目筛，备用。　　1.2HepG2.2.15细胞株购于北京大学附属医院病毒研究所。　　1.3试剂高糖DMEM(Gibco公司)，新生胎牛血清(Gibco公司),G418(Gibco公司),MTT(Sigma公司)，青霉素、链霉素(碧云天公司)，胰酶消化液(碧云天公司);HBsAg检测试剂盒(ELISA法)，上海科华生物工程有限公司产品;HBeAg检测试剂盒(ELISA法)，上海科华生物工程有限公司产品。　　2方法　　2.1鸡矢藤挥发油的提取用水蒸气法提取鸡矢藤的挥发油。精密称取鸡矢藤药粉100g，加1500ml三蒸

5、水于20009ml烧瓶中，50℃水浴浸泡8h。接挥发油测定器，电热套加热。微沸开始计时12h回流。冷却后，收集测定管中水层并用1∶1(V∶V)乙醚萃取3次。测定器用乙醚洗涤两次并收集，油层另外收集。乙醚萃取液加入无水硫酸钠干燥过夜，过滤。挥掉乙醚后所得物合并油层得鸡矢藤挥发油。　　2.2HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg规律试验将HepG2.2.15细胞按照1×105/ml接种于24孔板上，设置6个平行孔，每孔加含有G418的培养基1ml,另设置6个平行孔，每孔加不含有G418的培养基1ml。每天换一次培

6、养液并收集上清储存于-20℃，共6d。用ELISA法检测HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌量，以P/N值>2.1为阳性。同法重复试验并检测共3次。　　2.3MTT法检测鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞毒性试验以高糖DMEM、青霉素、链霉素、15%胎牛血清、G418浓度为380mg/L的条件培养HepG2.2.15细胞并传代。用含有1%DMSO(V∶V)的培养基10ml溶解50mg鸡矢藤挥发油，配制成浓度为5g/L的储备液，4℃下保存。用时取出用培养基稀释成2000，1000，500，250，

7、125，62，31，15mg/L等8个浓度梯度。将处于对数生长期的HepG2.2.15细胞以1×105/ml接种于96孔板，细胞贴壁后更换含有不同浓度挥发油的培养基100μl。并设置只用含1%DMSO培养基培养的对照孔，含1%DMSO培养基而无细胞的空白孔，每组均设定6个平行孔。继续分别培养24，48，72h后吸尽培养液，每孔更换为含有0.59g/L的MTT培养液100μl,37℃下培养4h后吸尽培养液，每孔加入100μlDMSO，孵育20min，充分振荡溶解结晶紫。然后在490nm波长与570nm参考波长下测定各孔的O

8、D值，根据各孔OD值求出挥发油对HepG2.2.15细胞的抑制率，并通过Reed-Muench法求出鸡矢藤挥发油的(半数中毒浓度)TC50。并通过CPE法镜检下确定鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞的(最大无毒浓度)TC0。细胞抑制百分率(%)=1-给药组OD-空白组OD对照组OD-空白组OD×100%(n=6)