低氧模拟物单独与联合氧化砷诱导早幼粒白血病细胞分化及其机制研究

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1、http://www.paper.edu.cn1CoCl2和DFO加强ATO对NB4细胞的诱导分化效应阎骅，王焰，彭振刚，沈志祥上海瑞金医院血液科，上海（200025）Email:yanhua_candy@yahoo.com.cn摘要：根据已有报道,低氧模拟物如氯化钴(CoCl2)和去铁胺(DFO)可以诱导白血病分化的结果,我们研究他们是否可以联合氧化砷加强对白血病细胞的诱导分化作用.APL细胞株NB4细胞和单核细胞系U937细胞分别加氧化砷(0.5uM)和50uMCoCl2和10uMDFO处理观察分化表达.结果发现,低氧模拟物可以

2、加强氧化砷抑制细胞生长和诱导NB4细胞分化的作用,而后者可以增强HIF-1的蛋白表达,但是这种效应并未发生在U937细胞,进一步的,低氧模拟物可以加速氧化砷对NB4细胞中PML-RARα蛋白的降解.另外,当我们利用诱导表达PML-RARα的U937/PR9细胞处理时,可以看到与NB4细胞类似的分化效应和HIF-1蛋白的增强表达.小结:低氧模拟物可以联合氧化砷促进细胞分化,并伴随HIF-1蛋白表达和PML-RARα的降解.可提示氧化砷治疗APL患者新的治疗机制.关键词：低氧模拟物，氧化砷，白血病，分化，低氧诱导因子1.引言正如大家所熟

3、知的，APL的发生与位于17号染色体长臂上的维甲酸受体α（retinoicacidreceptorα，RARα）基因的异常重排密切相关。继80年代我国学者利用ATRA成功治疗初发的APL患者后，研究者接着利用中国传统药物ATO治疗复发APL患者，发现每天静脉输注[1]ATO可以安全并有效治疗复发或对ATRA耐药的APL患者，所以该药先后通过中国药证局[2]和美国StateDrugAdministration对其的审批工作。同时我们的临床实验研究又进一步证实ATO联合ATRA治疗APL患者与单药组的治疗相比，可以进一步延长APL患者的

4、无病生存期[3]。但是不可否认，我们对该药物确切的作用机制尚不明了，目前我们知道1-2µMATO可[4]以诱导APL细胞调亡，我们也观察到ATO对其他实体肿瘤细胞有促凋亡作用。通过细胞学技术研究APL患者的骨髓标本，我们发现每日输注的ATO主要通过诱导APL细胞分化来发挥其治疗作用，Soignet等报道伴随ATO的治疗，代表原始的髓系细胞表达抗原CD33[5]阳性细胞比例逐步下降，而代表髓系分化成熟的抗原CD11b比例却稳步上升。利用[6]PML-RARα转基因小鼠白血病细胞建立的APL模型和hGM-CSF-producing转基因

5、SCID小鼠产生ATRA抵抗的UF-1APL细胞建立的肿瘤模型同样证明了ATO在体内的诱导分化[7]作用。体外研究中，1-2µM高浓度的ATO主要诱导APL细胞凋亡，而小剂量ATO(0.1-0.5µM)具有促进细胞分化的作用，但是作用甚微，明显不如该药物在体内的表现，于是我们大胆假设体内某一因素影响或是突出了ATO的表现，意外的是我们发现CoCl2和DFO，这两种低氧模拟物或2-3%低氧环境可以有效诱导髓系肿瘤细胞分化，他们的作用途径与ATO不同，它们并不降解PML-RARα融合基因，而是通过提高HIF-1α蛋白水平介导细胞分化，由

6、此，我们感兴趣的是，低氧模拟物是否可以影响ATO的表现，增强ATO诱导肿瘤细胞分化的作用呢？1本课题得到教育部博士点基金（低氧诱导白血病细胞分化的临床基础研究，20040266010）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn2.材料与方法2.1制剂纯度为99%的CoCl2和纯度为99%的去铁胺用灭菌双蒸水配制成50mM和5mM的储存液，分别予4℃和-20℃保存，需每月新鲜配制以保持药物的药效；0.1%ATO，以少量1.0mol/LNaOH溶解后，用1×PBS配制成5.0mmol/L的储存液，4℃保存；ATRA用无

7、水乙醇配成-210M储存液，4℃避光保存。以上四种制剂均购自Sigma公司(Sigma,StLouis，MO，USA)。2.2细胞及其培养本研究采用的白血病细胞系包括存在t(15;17)和对ATRA敏感的APL细胞系NB4(由法国Saint-Louis医院LanotteM教授友情提供)、人类单核细胞白血病细胞系U937细胞(上海生2+物科学细胞所细胞库)、U937/PR9细胞(经Zn诱导表达PML-RARα融合基因，由意大利PelicciPG教授提供)。上述的悬浮白血病细胞系接种于含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素，1

8、00µg/ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培养液(Sigma，StLouis，MO)中常规培5养(37℃，5%CO2)，同时每天换液，以保持细胞浓度维持在2-5×10/ml的最佳生长状态。细胞加药处理时，由于DFO