片微生物限度验证方案

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1、微生物限度检查法验证++==片微生物限度检查法验证小组二00五年三月++==片微生物限度检查法的验证1.目的：确认所采用的方法适合于+++=的微生物限度检查，即确认++==在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不计。以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。2.范围：适用于+==微生物限度检查方法的验证实施。3.测试环境条件要求：所有检查在环境洁净度10000级下的局部100级洁净度的水平单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境已定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子

2、、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证，并符合要求。4.内容：4.1.所用供试品为我公司综合制剂车间生产的片重0.36克规格的+===片，批号为050301050302050303。4.2.初步判断++==片无抑菌性，可直接用常规法进行实验。4.3.细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证过程4.3.1.菌种及菌液4.3.1.1.菌种：大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]白色念珠菌[CMCC（F）98001]黑曲霉[CMCC（F）98003]4.3.1.2.对菌种的要

3、求：无菌检查方法验证中所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），本试验所用以上各菌株传代次数分别为：大肠埃希菌，第3代；金黄色葡萄球菌，第3代；枯草芽孢杆菌，第3代；白色念珠菌，第2代；黑曲霉，第4代。4.3.1.3.菌液的制备：4.3.1.3.1.取经30~35℃培养18~24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄糖球菌、枯草芽孢杆菌的营养琼脂培养物，用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液备用。4.3.1.3.2.取经23~28℃培养24~48小时的白色念珠菌的改良马丁培养物，用0.9%的无菌氯化钠溶

4、液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液备用。4.3.1.3.3.取经23~28℃培养5~7天的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，用3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液备用。4.3.2.培养基的制备：取市售的脱水营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，分别按照说明书进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞按经过验证合格的灭菌程序进行灭菌备用。在试验前先加温熔化，然后放于45℃的恒温水浴锅中

5、保温备用。4.3.3.稀释液：用pH值7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，按规定配制后，采用经过验证合格的灭菌程序进行灭菌。4.3.4.实验中所使用的玻璃仪器及金属器皿在使用之前均经过170~180℃干热灭菌至少60分钟。4.3.5.供试液的制备：4.3.5.1.因为供试品的细菌总数及霉菌和酵母菌数的限值分别为10000和100，因此选择10-1和0分别作为细菌总数和真菌数方法验证的稀释级。4.3.5.2.称取供试品10g，分别加pH值7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml、10ml，加温助溶，温度不超过45℃，作为10-1、0两个稀释级的供试液。4.3.6.

6、计数方法验证过程4.3.6.1.试验组4.3.6.1.1.2个平皿做大肠埃希菌：每个平皿加1∶10的供试品稀释液1ml和大肠菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基15~20ml，倒置，30~35℃培养48小时。4.3.6.1.2.2个平皿做金黄色葡萄球菌：每个平皿加1∶10的供试品稀释液1ml和金黄色葡萄球菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基15~20ml，倒置，30~35℃培养48小时。4.3.6.1.3.2个平皿做枯草芽孢杆菌：每个平皿加1∶10的供试品稀释液1ml和枯草芽孢杆菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过4

7、5℃溶化的营养琼脂培养基15~20ml，倒置，30~35℃培养48小时。4.3.6.1.4.2个平皿做白色念珠菌：每个平皿加0稀释级的供试品稀释液1ml和白色念珠菌菌悬液1ml，然后倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15~20ml，倒置，23~28℃培养72小时。4.3.6.1.5.2个平皿做黑曲霉：每个平皿加0稀释级的供试品稀释液1ml和黑曲霉孢子悬液1ml，然后倾注温度不超过45℃溶化的玫瑰红钠琼脂培养基15~20ml，倒置，23~28℃培养72小时。4.3.6.2.菌液组：4.3.6.2.1.2个平皿做大肠埃希菌：每个平皿加大肠菌悬液1ml，然

8、后倾注温度不超过45℃溶化的营养琼脂培