铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究

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1、复旦大学硕士学位论文铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究姓名：谢红梅申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡必杰20040518铜绿假单胞菌生物膜形成影响闪素发相天基冈的研究中文摘要背景细菌生物膜(Biofilm，BF)是细菌粘附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋白和DNA等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力

2、，是临床上难治性感染的一个重要原因。近年来随着医学的发展，各种人工器官和留置导管使用的R益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。第一部分铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研究目的筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法方法分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型，用4种不同的方法分析：共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物膜的形成情况，CLSM观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡

3、一活菌计数法计数生物膜内的活细菌数。分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与CLSM结果相比较。结果CLSM观察显示24h生物膜内微菌落呈稀疏散在分布，72h生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落已融合，形成稳定成熟的生物膜结构；24h和72h生物膜厚度分别为27．6¨m、64．6pro。扫描电镜法显示72h生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。结晶紫染色法测得8h、16h、24h、48h和72h的吸光度值分别为0．08土0．04、0．20土0．07、0．41士0．33、O．47士0．33和0．68

4、+0．34，结果有统计学差异(P<0．001)。超声振荡一活菌计数法24h和72h的Logl0CFU／tJI导片分别为4．59士O．49和5．20-a：0．47，具有统计学差异(P

5、用超声振荡一活菌计数法检测不同培养时问(8h、24h、72h)、不同温度(23。C、37oC)、不同粘附材料(玻璃、硅胶)、不同液体流速(30ml／h、90ml／h)和不同培铜绿假单胞菌生物膜形成影响喇素发相天耩㈨的

6、

7、i7f究养基(M63、MH、LB)生物膜内活细菌数。结果固定培养基、培养温度、培养基流速及粘附材料，8h、24h和72h的生物膜内酒菌数(LogIoCFU／8jl导片)分别为4．01士0．26、4．59a：0．49和5．20a：0．47，P<0．00l；固定培养基、培养基流速、培养时间和粘附材料，23℃和37。C形成的生物膜内活菌数(

8、LogloCFU／B『导片)分别为5．12土0．43和5．30士0．42，P=O．039：固定培养温度、培养时间、培养基及培养基流速，生物膜引导片分别为玻璃和硅胶形成生物膜内活菌数(Log】oCFU／引导片)分别为5．49土0．59和6．21士0．40，P<0．001；固定培养温度、培养时间、培养基及粘附材料，培养基流速分别为30ml／h和90ml／h的生物膜内活菌数(LogloCFU／弓『导片)分别为5．44：t：0．58和5．83士0．52，P=0．002；固定培养温度、培养时间、培养基流速及粘附材料，分别以M63、MH和LB作为培养基形成的生物

9、膜内活菌数(LogloCFU／日I导片)分别为6．01士0．75、6．24+0．42和6．66土0．12，P<0．001。结论时间、温度、材料、流速和培养基均对铜绿假单胞菌生物膜有一定的影响。第三部分铜绿假单胞菌生物膜形成相关基因的研究目的检测铜绿假单胞菌生物膜形成过程中相关基因的转录，探讨生物膜形成的分子机制。方法培养24h和96h铜绿假单胞菌生物膜和相应对数期浮游菌，提取这些细菌的总RNA，进行反转录，运用半定量PCR技术扩增fliM、lasB和algU基因，并以16SrRNA作为内参照基因，分别比较浮游菌、24h生物膜和96h生物膜的fliM、

10、lasB和algU基因的光密度值。结果浮游菌、24h生物膜和96h生物膜的fliM／16SrRNA光密度比值