HIV1感染者免疫特征与耐药基因研究

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1、中国医科大学博士学位论文HIV-1感染者免疫特征与耐药基因研究姓名：张旻申请学位级别：博士专业：皮肤性病学指导教师：尚红2003.4.1中文摘要前言艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(AIDS)，由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起，主要感染破坏人体的CIM+T淋巴细胞，损害人体免疫系统，并发各种机会性感染，最终导致死亡，是人类最严重的传染病之一。至2002年底，全球有HIV感染者6000余万，其中有三分之一已死于艾滋病，无一国家可以幸免，我国HIV感染者已达100多万，处于艾滋病快速增长期，流行形势十分严峻。HIV进入机体后，感染、破坏CD4

2、+T淋巴细胞，而CIM+T淋巴细胞是调节机体免疫反应的关键细胞，病毒不断损伤破坏CD4+T淋巴细胞，导致机体免疫功能紊乱，最终破坏机体免疫系统，引发各种机会性感染，造成死亡。艾滋病治疗的目的就是通过抑制HIV复制来恢复或重建机体免疫功能。在抗Hi．V感染的免疫过程中，细胞免疫起着决定性的作用。当HIV感染CD4+T淋巴细胞后，CD4+T淋巴细胞产生并释放多种细胞因子，刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴细胞因子激活的杀伤细胞(LAK)、自然杀伤细胞(NK)等多种杀伤细胞分化、增殖，直接杀死HIV感染细胞，或通过CTL、NK分泌多种细胞

3、因子，如IFN一1、TNF—a迸一步刺激其它细胞的增殖、分化。细胞免疫中，细胞因子具有重要的调节作用。正常人体中，辅助T淋巴细胞(Th)分泌I型或Ⅱ型细胞因子，分别调节细胞免疫和体液免疫，相互制约，共同维持机体的免疫平衡。Imami等人发现体内细胞因子存在漂移现象，HIV—l感染早期I型细胞因子水平较正常对照高，而进入艾滋病期的患者体内以Ⅱ型细胞因子为主，GhoseR等人也证实I型细胞因子有利于保护HIV感染者，而Ⅱ型细胞因子则不利于病情的控制。目前国内少有关于细胞因子的研究报道，为了解我国HIV感染者细胞因子变化情况，我们选取了34例

4、HIV感染者对其体内细胞因子水平进行检测。目前艾滋病治疗主要是抗病毒药物治疗，最有效的方法是高效抗逆转录病毒治疗(HAART)，在HIV复制周期中最关键的两个阶段是HIVRNA的逆转录和病毒蛋白的翻译、加工，HAART治疗就是通过抑制病毒的逆转录酶(RT)和蛋白酶阻止HIV复制，达到清除体内病毒，恢复和重建机体免疫功能的目的。HAART治疗相对于单一药物治疗，增加了对病毒的作用靶点，产生相加或协同的更强的抗病毒能力，并减少了单一用药的剂量，降低了毒副作用，但长期的临床观察发现，HAART仍不能彻底清除潜伏于脑组织和淋巴结中的病毒，并且随

5、着HAART的广泛应用，发现HIV—l出现了交叉耐药和多药耐药，据美国和西欧的研究表明，约5—16％的新感染者已感染了HIV一1耐药株。国外研究已证明在治疗前检出耐药变异预示着抗病毒治疗失败或疗效降低，法国的VIRADAPT前瞻性研究发现，根据基因型分析结果改进治疗方案的患者治疗6个月后，病毒载量显著低于对照组(P<0．01)。Brindem和Caride等人发现，HIV一1耐药变异与病毒亚型有很大关系。我国目前还未开展大规模艾滋病临床治疗，少有关于ⅢV耐药研究的报道，随着我国艾滋病人数日渐增多，临床治疗已刻不容缓，我国HIV感染者的亚

6、型复杂，不能完全照搬国外耐药变异研究经验，因此，建立我国HIV耐药变异分析方法，进行病毒亚型与耐药变异相关研究，开展耐药监测对于我国艾滋病防治具有重要意义。材料和方法1．研究对象：所选病例均按‘中华人民共和国HIV／AIDS诊断标准》，经中国医科大学艾滋病确认实验室确认。2．流式细胞仪测定CIM+T淋巴细胞绝对计数3．美国Roche公司COBASAMPLOCOR自动载量仪测定血浆病毒载量4．34例感染者按1993年美国CDC艾滋病监测病例分类及扩大的诊断标准分为A、B两组，ELISA方法测定HIV一1感染者血浆中IL一12、IFN一％I

7、L一10、IL-6水平5．纯化HIV一1感染者血浆中HN一1RNA6．套式PCR扩增HIV一1RNApol区基因外侧引物：MAW一26：TTGGAAA7IBTGGAAAGGAAGGACRT一21：CTGTAT7丌℃TGCTATTAA∞℃，I-】盯7Im’I∞G内侧引物：PRO—l：CAGAGCCAACAGCCCCACCA．2．RT一20：锻GCCAGTTCT轰CATarGCTrC7．麓稼PCR扩镶产秘8．ABI377全自动DNA溅黪使测定薹差Ⅳ一1RNApol嚣部分蒸耀序列(蟹鑫酶1—99密褥子纛遂转嚣酶1—200密褥子≥测廖弓{豁：R

8、T一20：鼹GCCAGTFLWAC,CTCTGCT'rCRT—t：TTAAAGCCAGGA羽添GATCA；9。BioEdit软姆势橱测痒络慕，阏童每匿际参魄謦粼毖对，瓣剐爨是辩袭遂转录酶耐药基激变雾，并每疯