矢车菊素3O葡萄糖苷对细胞核受体活性及炎症因子的影响

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1、中山大学博士学位论文矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对细胞核受体活性及炎症因子的影响姓名：张英慧申请学位级别：博士专业：营养与食品卫生学指导教师：凌文华20090601◇中山大学博士学位论文矢车菊素-3-o．葡萄糖苷对细胞核受体活性及炎症因子的影响中文摘要到类风湿性关节炎、肠炎、肿瘤和早老性痴呆等疾病。LXRs尤其是LXRa对炎症和脂质平衡也起到非常重要的作用。LXRa分别参与了肠道胆固醇的吸收转运、外周组织的脂蛋白合成、胆固醇的逆向转运、肝脏的解毒和炎症抑制等过程的调节。受LXRa转活调控的与胆固醇转运和代谢相关的基因有ABCAl、ABCGl、ABCG5、AB038、HDL、APOE、

2、CETP、PLTP、CYP7A1、SREBP—lc等。LXRa配体激活了巨噬泡沫细胞中ABCAl、ABCGl的表达，促进胆固醇流出并转移至HDL，后者通过肝细胞上的受体进入肝脏代谢，LXRa还激活了CYP7AI进而增加胆汁酸的合成，胆管上的ABCG5和ABcG8被LXRa激活表达后则促进胆固醇排出体外。辅激活因子参与核受体活性的调节。类固醇受体辅激活因子(SteroidreceptorcoactivatorI,SRC．1)／p160可与包括PPART和LXRa在内的多种核受体结合，而后招募具有酶活性的CBP(cAMPresponseelementbindingprotein—bin

3、dingprotein)／p300和p／CAF(p300／CBPassociatedfactor)等，这些蛋白具有组蛋白乙酰基转移酶活性，使染色质结构改变，有利于基因转录。近年来NRs与炎症的关系备受关注。LXRa和PPARy可抑制某些受NF-KB激活的基因的转录，如病原体感染、IL-113、TNFa、LPS引起的iNOS、IL-1B、IL_6、COX-2、删P一9、McP—l、MCP一3的增加。报道认为PPARs和LXRs能通过与p65形成胞质穿梭复合物、调节p38MAPK活性、与NCoR共抑制复合体结合于NF-KB的靶基因等途径抑制NF_KB激活的靶基因的表达。同时TNFa或L

4、PS也可抑制LXRa和PPA脚的表达和活性，从而降低受二者调控的功能基因如载脂蛋白E、ABCAl、ABCGl和SREBP．1c等的表达。我们实验室的前期研究和相关文献报道C3G增加了PPAR丫和LXRa的表达以及转录活性。但是C3G调节核受体的作用机制尚不清楚，尤其是C3G是否作为配体直接调节核受体转录活性尚未见报道。我们在前期工作的基础上研究了C3G调节核受体PPAR7和LXRa转录活性的作用机制，并检测了C3G对受二者抑制的炎症因子TNFct和IL石表达的影响。研究方法：1、C3G对PPARY、LXRa等核受体的调节作用及机制分析Ⅱ◇中山大学博士学位论文矢车菊素-3．n葡萄糖苷

5、对细胞核受体活性及炎症因子的影响中文摘要(I)受C3G激活的细胞核受体的筛选实验将人肝脏细胞系L02接种于细胞培养板，用FuGENE@6分别将核受体(RXR、PXR、ER、FXR、LXRa、LXRIB、PPARa、PPARl"、PPARS)质粒、对应的核受体反应元件．萤光素酶和绿色萤光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)转染到细胞中。培养过夜，更换新鲜培养基继续培养，第二天加入相应浓度韵C3G孵育24小时，检测Luciferase强度和GFP强度(校正转染效率的内参)。(2)C3G与PPA脚转录活性及表达的关系①PPART转染实验将非洲绿猴肾细胞株COS一

6、7接种于lOem细胞培养板，按生产商提供的操作步骤，用FuGENE6转染试剂将含PPRE的质粒(PPREX3-tk-Luciferaseplasmid，PPREX3-tk．LUC)和内参质粒pRL．TK-Renilla转染至细胞，或者将PPRE×3-TK．LUC、pCGN4．hPPARy—HA质粒和pRL．TK．Renilta转染至细胞。重新接种并贴壁培养24小时。将不同浓度的C3G溶解到不含胎牛血清的DMEM中，孵育已转染质粒的COS．7细胞，以罗格列酮孵育组为阳性对照。PBS清洗细胞，细胞裂解液裂解，采用罗氏公司的DualLuciferaseReporterAssaySyste

7、m和萤光检测仪检测，以Renilla的强度作为校正。②C3G对PPARy表达的影响A、将人THP．1单核／巨噬细胞接种于六孔细胞培养板，以lOOng／n也PMA诱导分化48小时。PBS洗3次，换成含10％(v／v)胎牛血清的新鲜RPMI1640培养基培养24小时。饥饿12小时后以不同浓度的C3G干预培养16小对，采用实时定量PCR和westernblotting的方法分别检测PPA脚的mRNA和蛋白质含量。B、以蛋白酶体抑制剂PS341和C3G共同处理THP．1，we