玉米黄色素对肿瘤细胞的作用及其机制研究

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1、江南大学博士学位论文玉米黄色素对肿瘤细胞的作用及其机制研究姓名：孙震申请学位级别：博士专业：粮食、油脂及植物蛋白工程指导教师：姚惠源20061201摘要摘要叶黄素(Lutein，3,3’．二羟基．p，e．胡萝卜素)和玉米黄素(Zeaxanthin,3，3’．二羟基．B，p一胡萝h素)是玉米蛋白粉中含量较为丰富的类胡萝卜素。近年来的流行病学调查显示，叶黄素和玉米黄素在视觉保护、减少心血管疾病发病率、增强免疫功能和减少癌症的发生和发展等方面具有独特的生理功效；最新资料报道，补充人工合成的维生素类的营养剂会对人体的健康带来一些负面影响。本论文以玉米蛋白粉中的叶黄素和玉米黄素为研究对象

2、，通过分离纯化和鉴定，对玉米蛋白粉中叶黄素和玉米黄素抑制肿瘤细胞增殖的能力和机理进行了系统的研究，对其结构与功能的关系进行了初步的研究。通过对玉米蛋白粉中叶黄素和玉米黄素分离方法的研究，确定了以氧化镁为固定相，以石油醚：丙酮(65：35，v：v)为展层剂的薄层层析方法，并通过薄层层析方法的相对迁移率(Rf值)，紫外-可见光波谱分析，LC／MS，1H-NMR等方法对薄层层析的组分进行了定性分析，分离所得的叶黄素纯度约为90．09％，玉米黄素的纯度约为83．99％。以无水乙醇为溶剂，采用每天换液一次的方法，用MTT法确定了敏感于叶黄素和玉米黄素的肿瘤细胞；同时，对抑制肿瘤细胞作用的

3、剂量效应和时间效应进行进一步的研究。结果表明，不同来源的细胞株对叶黄素或玉米黄素的敏感性差异不一。叶黄素、玉米黄素作用于人口腔上皮癌细胞KB72h后的半数致死浓度Ic50分别为47．51unol／L和31．04pmoFL，对人胎肝细胞L02的半数致死浓度Ic50分别为164．12pmol／L和87．45pmoFL。采用形态学方法分别通过相差显微镜，荧光显微镜和扫描电镜对叶黄素和玉米黄素抑制KB细胞增殖的机理做了初步的研究。在相差显微镜下，经过叶黄素和玉米黄素作用的细胞体积变小，增殖速度减慢，细胞的形态发生改变，细胞逐渐变成圆形，折光性增强，继而开始皱缩，部分细胞脱落，悬浮在培养

4、瓶中。单细胞凝胶电泳的分析结果表明，KB细胞经30、40pmol／Lt米黄素和40、609mol／L叶黄素作用48h、72h后，呈现典型的“彗星”现象，细胞的尾长及全长和实验对照组相比显著增加(P

5、4．1％；609mol／L叶黄素下降至51．4％。由此推断叶黄素和玉米黄素对KB细胞增殖的抑制，可能是通过阻止细胞由Gl期向S期的转变，影响细胞DNA的合成，使其向正常细胞转化而实现的。采用流式细胞仪检测细胞内游离ca2+浓度的变化，结果表明KB细胞内【C狎i随叶江南大学博士学位论文黄素或玉米黄素作用而有所上升并呈现时间和剂量依赖效应：采用流式细胞仪测定基因产物的表达量发现，通过叶黄素和玉米黄素处理KB细胞后，其凋亡基I盈p53、Bax基因蛋白转译水平显著增加，而抗细胞凋亡Bcl一2基因蛋白转译水平显著下降；Bcl．21Bax的比率显著下降。小鼠腹腔巨噬细胞在LPS刺激下，叶黄

6、素51anol／L，玉米黄素为2．5junol／L时对巨噬细胞产生NO表现为抑制作用；叶黄素的浓度在30,--400mol／L范围内、玉米黄素在301．maoFL浓度范围内可显著性促进小鼠腹腔巨噬细胞生成NO，NO的增长率分别为36．9-42．3％和22．5％(p-<0．01)。在5---409moFL剂量范围内，叶黄素和玉米黄素均可增强腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，吞噬率分别增加了6．2％～24．4％和8．4％～26．3％。10-501xmol／L玉米黄素和10--．301xmoFL叶黄素对L929细胞的增殖既无促生长作用，也无细胞毒作用。但是2．5-．-,40p．mol／L

7、叶黄素和玉米黄素可以诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF．e1．，其细胞毒性分别为5．6~21．2％和7．5~20．7％。用化学法对叶黄素和玉米黄素进行了羟基乙酰化修饰，得到了纯度分别为87．37％双乙酰化叶黄素和79．06％双乙酰化玉米黄素等产物，并用LC／MS和1H猢对所获得产物进行了结构鉴定。用MTT法对乙酰化产物和修饰前的化合物抑制KB细胞增殖的能力进行了比较，结果发现，乙酰化后分子抑制KB细胞增殖的能力有所降低，且在501．tmol／L时下降呈显著性差异(p<0．05)。但是分子的稳定性