红法夫酵母酶法破壁提取虾青素及其β环糊精包合的研究

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1、华南理工大学博士学位论文红法夫酵母酶法破壁提取虾青素及其β-环糊精包合的研究姓名：蹇华丽申请学位级别：博士专业：发酵工程指导教师：梁世中20050401摘要摘要红法夫酵母坚韧的细胞壁严重阻碍了其细胞内虾青素的提取及应用，因此建立合适的细胞破壁方法以提高虾青素的生物利用度及提取率是一个急需解决的关键问题。本论文研究了环状芽孢杆菌胞壁溶解酶的发酵生产及其用于红法夫酵母破壁提取虾青素，以及红法夫酵母虾青素的稳定性及其芦一环糊精包合保护方法，主要实验结果如下：对环状芽孢杆菌占．cfrc“肠一JA1．383进行紫外线诱变

2、处理，经过初筛、摇瓶复筛以及传代稳定性实验，获得一株稳定高产胞壁溶解酶的突变株A1．383．2，其胞壁溶解酶产量比亲株提高了116．9％。通过对其发酵产酶条件的优化实验，得出其生产胞壁溶解酶的适宜条件：碳源采用酵母葡聚糖，浓度为lOg／L：氮源为蛋白胨与(NH4)2S04混合，使其总浓度为4g／L；接种量6％～lO％(v／v)；摇瓶装液量为250mL三角瓶装液40mL：发酵温度为30℃～35℃；培养基初始pH6．5～7．0。在上述条件下发酵54h后可获得最高酶活74．6“mL，比优化前酶活提高了38．7％。通过

3、单因素及均匀实验设计，确定了将且曲_c“，4一sAl．383．2胞壁溶解酶用于红法夫酵母破壁提取虾青素的最佳酶作用条件，即当pH值为5．O，加酶量为1614．5ll／g干酵母，37℃温和震荡反应16．5h，虾青素的提取率可达到98％以上；此胞壁溶解酶稳定的pH值范围为4．8～9．8，在50℃以下表现出很好的热稳定性；对此胞壁溶解酶中多种酶活进行了测定，确定该复合酶含有算．1，3．葡聚糖酶、纤维素酶、中性蛋白酶、几丁质酶、淀粉酶以及木聚糖酶活性。2．脱氧．D-葡萄糖的存在会影响葡萄糖的正常代谢以及酵母细胞壁的合成

4、，但实验表明，红法夫酵母培养中添加O．005g／L．O．02g／L的2．脱氧．D．葡萄糖却可促进虾青索积累，而且生物量基本保持不变，在增加虾青素产量的同时还能缩短酶法破壁的时间。当2-脱氧．D．葡萄糖添加浓度为O．02g／L，且在红法夫酵母培养的前36h添加时，虾青素含量可提高到对照组的113．7％，采用胞壁溶解酶对红法夫酵母破壁提取虾青素，作用12h提取率可达94．7％。推测2．脱氧．D．葡萄糖促进虾青素合成的机理是由于其在细胞内抑制了电子传递链的某个酶，从而阻断呼吸链，造成氧自由基的大量积累，促使虾青素的合

5、成。通过对红法夫酵母与环状芽孢杆菌两阶段混合培养条件的优化，总结出红法夫酵母产虾青素及酶法破壁提取的适宜工艺为：培养基初始糖浓度为30g／L。环状芽孢杆菌的最佳接种时间为红法夫酵母培养60h～72h，接种量为10mL／L(10旧个细胞／mL)，接种后最适培养温度为30℃，pH为6．5，总发酵时间为120h，在此条件下，红法夫酵母虾青素产量可达到8960．2ug／L，虾青素最终提取率可达到96．8％。在两阶段混合培养实验结果的基础上，设计了红法夫酵母与环状芽孢华南理工大学博士学位论文杆菌三阶段混合培养方案，发酵结

6、果表明，当在培养基中添加0．02g／L的2．脱氧．D．葡萄糖，三阶段混合培养明显优于两阶段混合培养，不仅最终的虾青素产量提高到9563．4ug／L，发酵时间也缩短为108h，提取率提高到97．4％，最终可提取出的虾青素总量为9314．8ug／L。虾青素对短时受热有较好的稳定性，对光却非常敏感，但无论是在加热还是在光照条件下，酶法破壁提取的虾青素比酸法及珠磨法破壁提取的更为稳定：当暴露在空气中时，氧成为虾青素褪色的另一个主要因素；有机溶剂中极性最小的石油醚有利于虾青素的保存，而极性最大的丙酮则十分不利于色素的保存

7、，色拉油能很好的保护色素，因其较好地隔离了空气中的氧，起到了一定的屏蔽作用。所以，应采用避光、密闭、充氮或真空、低温贮存的方法来延缓红法夫酵母虾青素的褪色。皂化能提高虾青素一芦一环糊精包合的包合率；通过正交试验对包合物制备条件进行优化，可知在本实验范围内，影响包合率各因素的主次为：D(转速)>c(时间)>B(温度)>A(环糊精用量)，其中转速为显著影响因素；通过对搅拌时间及温度进行扩展试验，确定了最佳包合条件为：p一环糊精加入量为7g／50mg虾青素，温度40℃，搅拌转速600r／min，搅拌时间5h，在此条件

8、下制备虾青素一芦一环糊精包合物，其包合率高达87．77％。于50℃，5000lux光照条件下对经皂化后的包合物进行稳定性加速实验，结果表明其稳定性与未经包合的虾青素提取液相比提高了约20倍。采用红外光谱及x．射线衍射对虾青素、卢．环糊精、两者的物理混合物及两者包合物的结构进行分析，发现包合物的结构与相应的主客体以及主客体混合物的结构有明显不同，说明包合物形成后已构成新的固体相。关键词：