放线菌有序基因组文库的构建和应用及遗传因子的研究

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1、华中农业大学博士学位论文放线菌有序基因组文库的构建和应用及遗传因子的研究姓名：夏海洋申请学位级别：博士专业：动物学指导教师：杨长举20061001夏海洋放线苗有序幕因组文库构建和戍用及遗传冈予研究华中农业人学2006届博十学位论文段的效率可达10％以上。利用该体系尝试了&coelicolor多个染色体大片段敲除。利用pHAQ31和SuperCosl构建的两套&avermtitilis基因组文库，构建了敲除Savermtitilis的除A、蝴血合成以外9个聚酮类抗生素生物合成基因簇载体，并完成了部分8基因簇的敲除工作。4马杜拉霉素(Maduram

2、icin)生物合成基因簇中聚酮合成相关基因片段的克隆。以pHZl358为载体构建了马杜拉霉素产生菌A．yumaensis的基因组文库。利用从该菌中克隆到的内源探针，对基因组文库筛选获得了9个阳性克隆，通过阳性克隆的两端测序分析，发现4个克隆两侧显示出与聚酮合成酶高度同源，推测可能和马杜拉霉素的生物合成相关。5链霉菌温度敏感性线型质粒pRIA的复制功能研究。链霉菌44414携带3个内源线型质粒，在40度培养条件下，其中pRIA质粒发生丢失(温度敏感性)。通过部分酶切和克隆鉴定了pRI_A的基本复制区域，由一个与&avermtilis中线型质粒sA

3、Pl相似的新的基因和一段非编码区组成。通过比较鉴定了＆avermtilis中线型质粒SAPl的中心基本复制区。6诺卡氏菌环型质粒pXTl07的复制研究。在Nocardiasp．107中发现质粒pXTl07是诺卡氏菌属中报道的最小的环型质粒之一，由4335bp组成。序列分析及功能研究显示，该质粒具有典型的滚环复制质粒的特征。构建的大肠杆菌一诺卡氏菌穿梭质粒pHAQ22能够在Ⅳcorallina4．1037中复制，但不能在变青链霉菌假伽idans)中复制。7A．yumaensis染色体基本复制区的克隆及分析。利用根据dnaA和dnaN保守序列设计的

4、简并引物在马杜拉放线菌中扩增到1．3kb片段。研究发现，尤马马杜拉放线菌染色体复制区位于保守基因dnaA与dnaN之间，包含919碱基对。与已发表的3个属的放线菌染色体oriC序列的特征不同，尤马马杜拉放线菌的染色体oriC含有14个DnaA盒子和2个AT富含区，DnaA盒子的保守序列是(T／C)(T／C)GTCC(A／C)CA。携带该oriC片段的大肠杆菌质粒可以在天蓝色链霉菌中复制和以低拷贝方式遗传。比较来自放线菌4个属的oriC，发现以oriC序列和以16SrDNA序列构建的进化树十分相似，进一步支持了前人的推测。关键词：放线菌；有序排列

5、的基因组文库；基因替换；次生代谢工程；遗传因子；温敏线型质粒II英文摘要Abstract11地actinomycetes．filamentousbacteriabelongtohigh眦contentgram-positivegroup,haveacomplexmorphologicaldevelopmentanddifferentiationlifecyclewithuniquegeneticscharacters．Andproducemorethan8700kindsofantibioticsandphysiologicalactivity

6、chemical．Soactinomycetesweretakenasimportantmaterialsinfundermentalandapplicationresearchonmicroorganism．Inthisthesis,investigationonfunctionalgenome,antibioticbiosynthesisandDNAreplicationwerecarriedoutonStreptomycesavermililisandActinomadurayumaensis(withhi曲commercialvalue

7、s),Streptomycescoeficolor(themodelaetinomycetes)．Streptomyces．sp．44414andNocardiasp．107．n圮resultsarcfollowing：l低constructionofanorderedgenomiclibraryof&avermitilisandobtainmentthegenetic-engineeringstraintoproduceDoramectin．AgenomiclibraryofS．avermitiliswasconstructedwith．th

8、ecosmidvectorSuperCosl．Aftersequencedthebotllendsof1000cosmidclones，anorder