P2X3受体介导骨癌痛痛觉敏化机制的研究

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1、第二军医大学博士学位论文P2X<,3>受体介导骨癌痛痛觉敏化机制的研究姓名：吴镜湘申请学位级别：博士专业：麻醉学指导教师：俞卫锋20080401独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：羡庇荆签字日期：渺酶萌吒学位论文使用授权书声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本

2、人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：灵堍滑导师签名：签字日期：渺万年S月If日签字日期：锄1日易心何一莎DP2X3受体介导的骨癌痛痛觉敏化机制的研究摘要疼痛是癌症患者最为常见的症状之一，据统计，大约30．50％的癌症患者会有中到重度疼痛，尤其是晚期癌症的患者，约75．95％会发生难以控制的慢性疼痛。不少癌症患者就诊时的首要症状就是疼痛。由于癌症痛的机制尚不明了，仍约有45％的癌症痛得不到有效控制，因此研究癌症痛机制，寻找缓解癌症痛的新方法，提高肿

3、瘤患者生存质量，成为当前急需解决的问题。临床最常见的三大肿瘤为肺癌、乳腺癌、前列腺癌，此类肿瘤晚期很容易发生骨转移，而骨癌痛则是慢性癌痛最为常见的一种，因此从研究骨癌痛的发生发展机制入手揭开癌症痛的机制有重要的临床意义。2002年Medhurst等首先建立了大鼠骨癌痛模型，为探索骨癌痛的发生机制，寻找有效的治疗方法提供了良好的机遇。但其所用的MRMT-1乳腺癌细胞国内较难获得，因而不少学者仍在探索新的肿瘤细胞株来建立大鼠骨癌痛模型。本课题组前期研究采用Walker256细胞探索建立大鼠的骨癌痛模型取得了成功。在模型动物中，荷瘤侧肢体表现出负重减少、异常性疼痛或痛觉过敏等相关行为学改变，其程

4、度与骨质破坏程度密切相关，与临床癌症痛表现出相似特征。而相应的脊髓节段也发生一些特征性的神经化学改变，提示骨癌痛是一种特殊类型的疼痛，神经传递通路上存在有痛觉敏化机制。近年来在疼痛机制的研究中P2X受体的作用逐渐受到重视，P2X嘌呤受体为ATP的受体，是配体门控阳离子通道，有7个亚单位，其中P2X3亚单位高度选择性表达于小直径的感觉神经元，与痛觉信号传递密切相关。那么ATP及其P2X3受体是否参与了骨癌痛的痛觉敏化机制昵?某些研究提示了一些线索，Maehara等发现在肿瘤组织中ATP含量明显高于正常组织，而Gilchrist等在小鼠骨癌痛模型中进行免疫荧光检测发现其周围神经末梢纤维P2X3

5、受体表达显著增多，而且从神经纤维的分类上看主要表现为与肽能神经纤维共表达增加。这些发现似乎暗示着P2X3可能参与了骨癌痛痛觉敏化的外周敏化机制。由于脊髓背根神经节(DRG)是初级感觉传入神经元胞体所在地，因而本研究计划从DRG入手研究骨癌痛痛觉敏化机制。本课题分四个步骤(1)通过大鼠胫骨内注射walker256乳腺癌细胞建立骨癌痛模型并观察其行为学变化的特点；(2)观察DRG神经元中P2X3受体mRNA和蛋白表达情况；(3)利用全细胞膜片钳技术分析DRG神经元P2X3受体功能的变化；(4)利用在体实验运用P2X3受体的阻断剂suramin鞘内注射是否能够缓解骨癌痛。通过以上实验探讨P2X3

6、受体是否和如何参与了骨癌痛的痛觉敏化过程。结果如下：1．模型建立情况第二军医大学博士论文雌性Wistar大鼠胫骨内接种2×105个Walker256细胞，接种肿瘤后(PID)21d统计致瘤率70％，大鼠PIDl0天开始出现自发痛(SPAS)评分增高，在PIDl4～21天出现明显的跛行或后肢不负重，部分大鼠对患侧足有自噬现象，同时伴有进食减少，体重下降；诱发痛实验主要表现为机械性痛觉过敏而无明显的热痛觉过敏，与文献报道一致。，影像学观察PID8天时尚无明显改变，至PID21d时可见骨质明显增生，病理检查可见晚期胫骨外观呈膨胀性增生，胫骨内有肿瘤生长，同时有破骨和成骨样改变。脊髓切片GFAP染

7、色见患侧星形胶质细胞明显增生。以上结果表明大鼠骨癌痛模型成功建立，模型主要行为学特征为机械性痛觉过敏和自发性运动疼痛。2．P2X3受体在DRG神经元中的表达免疫荧光标记见骨癌痛模型组患侧L4～U节段DRG神经元P2X3在PIDl4天、21天时表达明显增高，主要表达在中、小直径神经元。对照组、假手术组、骨癌痛组14天、21天P2X3受体阳性神经元百分比率分别为30．71％、32．3％、48．78％和46．27％。weste