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1、盐胁迫下烟草蛋白质组学分析摘要通过蛋白质组学分析，烟草植物对盐胁迫的影响机制被进行了检测。烟草植株被放于0，150，250，300或400mM氯化钠中处理。在150mM或以上NaCl处理组中，植株呈现鲜重减少和脯氨酸水平增加现象。从置于150mM氯化钠的烟草植物叶子中被提取的蛋白质进行2-DE分离。在每个凝胶可重复检测的205个蛋白点中，有18个点在NaCl处理下出现差异性表达。上调的蛋白质参与其光合作用，而下调的蛋白质与自我保护功能相关。剂量和时间依赖性研究表明，一个基质的70–kDa热休克相关蛋白由于NaCl的影响而出现显著

2、下调。因此，基质中的70-kDa热休克蛋白在盐胁迫下下调可能是植物没能成功保护自身细胞抵抗盐胁迫的原因所在。关键词：脯氨酸；蛋白质组；盐胁迫；烟草1引言在环境中，植物必须能够广泛抵抗生物性和非生物性胁迫。土壤盐化是一个重大环境问题，它严重威胁到了世界各地植物的生长和生产力[3]。盐度诱导多种高等植物代谢的变化。在自然条件下，植物进化出了几种机制，以应付盐的存在。然而，我们对这些机制的认识是不完全的，因为盐引起的胁迫的复杂性，此复杂性包含了离子和渗透等方面的因素[3]。可容性溶质，如糖和氨基酸，在大多数生物中积累，并负责调节细胞的

3、内部渗透压[9]。游离脯氨酸在高渗条件下植物的渗透势调节中起到了重要作用[13]。脯氨酸既是一种保护剂又是一种自由基清除剂。因此，植物可能过量产生脯氨酸来试图规范其细胞质的pH值[40]。高等植物在渗透胁迫下从谷氨酸合成脯氨酸。从谷氨酸合成脯氨酸的前两个步骤被一个双功能酶催化，即三角1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS），这是一个在合成路径上的速度限制酶，表现出γ-谷氨酰激酶和谷氨酸-γ-半醛脱氢酶两种生物活性[41]。由于盐度的反应的复杂性，各种方法已应用于其研究。蛋白质组分析研究是对非生物胁迫反应研究最常用的方法之一，因为该

4、方法具有提取蛋白质的简易性，凝胶的可重复性，和质谱对称性（MS）及蛋白质测序[20]灵敏度良好等优点。H+运输ATP合成酶β链，一些过氧化物酶，小RasGTP结合蛋白等物质在盐胁迫下其合成水平增加[32]。在水稻中，GTP结合蛋白，β-亚基样蛋白，凝集素样蛋白，Rubisco活化酶，铁[35]，果糖二磷酸醛缩酶，光合放氧复合蛋白，氧释放增强剂（OEE）蛋白2和超氧化物歧化酶（SOD）是由于盐胁迫而上调[1]。在Suadaaegyptica叶中，对氧化胁迫的耐受性有关的生理活动，如甜菜碱合成，光合作用，ATP的产生，蛋白质的降解，

5、氰化物解毒，和伴侣的活动等活动的有关蛋白质上调[4]。近日，Aghaei等人报道[2]，晚期胚胎发生丰富蛋白，β-球蛋白，激发子肽的前体，和基础/螺旋-环-螺旋蛋白，在大豆根和下胚轴处于盐处理下时被上调。因此蛋白质组分技术在研究盐胁迫机制方面是非常有用的。因为烟草植株成长快速，且其DNA能够操纵，所以烟草是在植物生物学上非常有益和重要的的模型系统[31]。米柯瓦依契克等研究了烟草细胞中对盐胁迫立即响应机制中的两种蛋白激酶[26]。两个激酶中的一个属于丝裂原活化蛋白激酶家族，第二是拟南芥丝氨酸/苏氨酸激酶1，与蔗糖非发酵1激酶家族

6、成员属于同源蛋白。在盐胁迫下的烟草叶质外体中，两个几丁质酶以及germin样蛋白上调，两个脂质转移蛋白的表达受限，但一些参与细胞壁修复的质外体多肽没有变化[11]。也有报道说，在烟叶皮毛中，应力防御反应的成分，如SOD，谷胱甘肽过氧化物酶和内源性酶强烈表达[3]。但是，我们对胁迫如何影响蛋白质成分在烟草中的表达仍然有一个认识上的缺乏。在本研究中，蛋白质组分分析法是用来检测烟草这一模型植物对盐胁迫影响反应机制的。为此，烟草幼苗叶蛋白通过2–DE法来进行分析，那些表达水平由于盐胁迫而发生改变的蛋白质在其中被检测出来，还有那些主要的差

7、异表达蛋白质也能通过埃德曼测序和质朴分析予以鉴定。2材料与方法2.1植物生长和NaCl环境培养烟草种子（烟草C.V，威斯康星州）被表面消毒之后在无菌条件下被种植在Murashige和Skoog媒介上，然后将其放在25.8℃和相对湿度为90％的生长室中，用白色uorescent光（600mmol㎡／S;16h光照/8h黑暗）照射。等发芽之后两个月时，将烟草进行传代，之后18至20天时生根。然后植株被转移到分别含有0，150，250，300和400mM氯化钠的液体Murashige和Skoog培养基中。4周后，测定叶和根的鲜重和脯氨

8、酸含量。2.2测量游离脯氨酸含量脯氨酸含量的测定先采用茚三酮反应法大体估算。取一份（0.5克）叶片和根系，加10mL的3％的磺基水杨酸（W/V）进行匀浆，之后再将匀浆通过Whatman2号滤纸进行过滤。取过滤后的滤液2ml进行测量，在其中加入2ml的茚三酮和2m