[自然科学]免疫学试验技术

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1、用途种类定性定量定位直接凝集试验++-凝集试验间接凝集试验++-SPA协同凝集试验++-桥梁凝集试验++-絮状沉淀试验++-沉淀试验琼脂扩散试验++-免疫电泳+--火箭免疫电泳++-补体参与的补体结合试验++-试验免疫荧光抗体技术+++标记抗体技术免疫酶技术+++同位素标记技术+++中和试验中和试验++-l种类：1.凝集试验细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下可逐渐凝集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集反应（直接凝集试验）。l间接凝集试验将可溶性抗原或抗体结合在一种与免疫无关的惰性微粒表面，然后与相应的抗体或抗原作用，在有电解质存在的适

2、宜条件下，微粒即可被动的被凝集，出现肉眼可见的凝集现象。通过微载体进行的凝集试验叫间接凝集试验，也称微载体技术。l常用的微载体：致敏红细胞、聚苯乙烯乳胶、炭粉颗粒AgAgAg载体Ag载体AgAg+AgAgAg（红细胞、乳胶、炭）间接凝集反应Agl将抗原结合在微载体上进行的凝集试验叫“正向间接凝集试验”；将抗体结合在微载体上进行的凝集试验叫“反向间接凝集试验”。lSPA协同凝集试验葡萄球菌A蛋白（staphylococalproteinA,SPA)是葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种动物IgG的Fc片段结合。特异性的IgG的Fc片段与SPA结合后，其Fab片段仍保持与特异性

3、抗原结合的特点而发生抗原抗体反应，从而导致葡萄球菌的凝集。桥梁凝集试验又称Coombs抗球蛋白试验，用于检测不完全抗体。单价抗体只有一个抗原结合部位，不会产生凝集反应，当加入抗球蛋白抗体后，可以将两个各连结一个抗原决定簇的单价抗体再连结起来，出现凝集。l2.沉淀试验可溶性抗原与相应抗体结合所发生的沉淀反应(precipitation)。如细菌、寄生虫的浸出液、组织浸出液、培养滤液、动物血清等，与相应Ab相遇后在有电解质存在下Ag-Ab复合物相互交联形成免疫复合物达一定大时，可出现肉眼可见的沉淀反应。l沉淀抗原是细胞的浸出成分，为细微的胶体溶液，单个抗原的体积小而总面积大，

4、出现反应需要的抗体量多l沉淀试验可分为环状/絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。免疫电泳技术将琼脂扩散试验与电泳技术结合起来的一种免疫检测技术。在Ag、Ab在凝胶中扩散的同时加入电场作用，使Ag、Ab的扩散速度加快，同时限制了扩散的方向，增加了试验的敏感性。-+AgAb补体结合试验是可溶性抗原与相应抗体结合后，可以再结合补体，但这一反应不能被肉眼观察到，可加入红细胞及其抗体（溶血素），根据是否溶血来判定反应系统是否存在相应抗原抗体，如红细胞不溶解说明存在相应的抗原抗体，为阳性反应；如溶血则说明不存在相应的抗原抗体，为阴性反应。l检测系统Ag+AbAg-AbAg-Ab-补

5、体+补体红细胞+溶血素红-溶（不溶血，阳性）指示系统红-溶-补体（溶血，阴性）4.标记抗体技术标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子(标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。标记抗体技术=免疫技术+标记技术抗原抗体反应示踪物标记特异性灵敏性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏性常用的免疫标记物质类别标记物用途荧光素FITC、RB200等免疫组化免疫分析测定酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定放射性核素3H、14C、32P、57Gr、125I、131

6、I免疫分析测定l4.1.1原理：荧光素在紫外线照射下可发出肉眼可见的荧光，其与抗体结合后仍保持其本身的特性。l荧光抗体与相应抗原结合后，（1）通过荧光显微镜观察可测知抗原的存在及部位；（2）依荧光强弱也可测知抗原量的差异。4.1.2荧光抗体的标记l（１）免疫球蛋白（IgG）的提取：硫酸铵盐析法、DEAE-纤维素提取法。l（２）荧光抗体的标记：标记Ab常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（FITC，为黄色或橙黄色结晶粉末，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光）和四乙基罗丹明（RB200，为橘红色粉末，最大吸收光波长为570nm，

7、最大发射光波长为595－600nm，呈橘红色荧光）。lFITC的标记如下：l①浓缩后的IgG、定量、稀释（10~20mg/ml）.l②FITC按蛋白量的1/80－1/100加入。应用pH9.5的0.5M碳酸盐缓冲液将FITC进行溶解。l③IgG稀释液与FITC溶液按１０:1配合，FITC液缓慢地加入到IgG稀释液中，防止出泡。l④避光以电磁搅拌器搅拌，其反应时间与温度有关。2－4℃须6h20－25℃须1－2h即可。一般以低温标记为最好。⑤应用透析法、盐析、凝胶过滤法除去未结合的游离荧光素。l4.2.3应用主要用于检测抗原（定性