第15章 细胞毒免疫学试验技术.doc

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1、第15章细胞毒免疫学试验技术免疫应答进行中，既有非特异杀伤细胞和特异性杀伤细胞，同时既有非特异细胞毒分子（因子），和特异性细胞毒因子，它们的免疫反应结果会导致靶细胞裂解死亡。一、癌细胞的杀伤研究：随着免疫学技术的发展，近年来对癌细胞杀伤的免疫效应报告甚多。大体为：1、非特异杀伤肿瘤细胞：如自然杀伤细胞（NK细胞）、K细胞，是体内抗肿瘤的第一道防线，NK可自发杀肿瘤细胞，K细胞依赖于抗肿瘤细胞的抗体存在而发生杀肿瘤效应。体外可用细胞毒试验方法来进行研究。通常采用51Cr释放试验来观察其杀伤效应。2、特异杀伤肿瘤细胞：人体内

2、特异杀肿瘤细胞为TC（或TK）杀伤效应，该细胞的特异杀伤需要特异抗原预先致敏TC（或TK）细胞，以区别于非特异杀伤。3、某些淋巴因子的调节作用：近年来人们用IFN（特别是IFN-r）、IL-2等细胞因子来处理淋巴细胞均可大大增强NK、K、TC细胞等杀伤效应，特别是用IL-2培养癌症患者淋巴细胞可诱发和激活LAK等杀伤细胞，经体外增殖达一定量时再输回患者体内，可治疗晚期癌症。有关LAK细胞的制备和测定杀伤效应的方法见第三篇第四章。4、中草药对杀伤细胞的调节作用。中草药是祖国医药宝库。有许多补气类中草药及其提取物（如多糖或皂

3、甙成分等）已在临床用于治疗肿瘤，体外细胞培养技术证明中草药中的人参、黄芪、刺五加、茯苓等均可促进细胞产生干扰素（IFN-r、β、α）、白细胞介素-2（IL-2）和增强NK、K、TC的杀伤效应。5、单克隆抗体的生物导弹作用：近年来已有许多癌细胞的单克隆抗体出现，若将杀肿瘤的毒性药物挂在抗体上，再将此抗体作为导弹输入患者体内，该抗体一旦与体内肿瘤细胞特异结合可发挥杀肿瘤效应。目前已在体外细胞培养中获得了许多证据，不久将指导用于临床。若与上述淋巴因子制成联合剂型可能效果更好。6、药物的毒性作用：为了筛选理想的癌细胞毒性物质或抑

4、制物质如化疗药物，通常采用相应的癌细胞进行体外试验，以寻找最佳化疗药物和适宜的药物浓度，为临床用药提供依据。二、细胞毒试验：细胞毒试验是在组织培养中研究淋巴细胞、抗体或抗体依赖性淋巴细胞杀伤靶细胞的一种技术，也是在体外研究特异性细胞免疫比较可靠和灵敏的方法，目前微量细胞毒试验是应用最广的一种方法。(一)淋巴细胞对瘤细胞的细胞毒试验：(1)瘤细胞培养物制成悬液，并稀释至需要的细胞浓度。(2)于微量试验板的小孔内分别接种0.2ml瘤细胞(内含5×102个细胞)，37℃培育24小时。(3)细胞贴壁后，轻轻倾去培养液，加1mlP

5、BS洗涤，倾去洗涤液及未贴壁细胞。(4)向小孔分别加入0.2ml淋巴细胞(分别含有5×105×104，5×103个细胞)，使淋巴细胞与瘤细胞之比依次为1000:1、100:1、10:1。(5)45分钟后加0.1ml5%胎牛血清，37℃继续培养2～3天。(6)2%台盼兰染色，翻转微量试验板，计数活存的瘤细胞，并设有正常人淋巴细胞代替肿瘤患者淋巴细胞作对照，每份需同时作三个复孔，分别检查各孔中活存细胞数，按下列公式计算细胞毒%，并作t检验。对照组小孔活存细胞数—试验孔活存细胞数细胞毒%=×100%对照组小孔活存细胞数对照组小

6、孔成活细胞数-试验孔成活细胞数细胞毒(%)=———————————————————————×100%对照组小孔成活细胞数(二)抗体加补体的细胞毒试验：此法是组织相容性（抗原HLA）检查技术中最常用的一种方法。也称微量淋巴细胞毒试验。人体的组织相容性抗原存在于淋巴细胞膜的表面，从供者与受者的血液分离淋巴细胞作为靶细胞，以各种定型单价抗血清与家兔血清补体作为效应系统。如果淋巴细胞表面具有与抗血清相对应的抗原，则淋巴细胞就会受损伤或致死而被台盼兰着色，方法如下：材料：淋巴细胞分离方法见前：血清：小牛血清(56℃30分钟灭活)待

7、测血清：收集多产妇分娩时的胎盘剥离后的血，分出血清，叠氮钠防腐，4℃保存。已知阳性对照血清：用上海市中心血站制备的马抗人淋巴细胞血清(ALS)，同时作1:3稀释。补体：新鲜家兔混合血清，分装小试管，保存于-20℃。步骤：(1)在塑料试验盒(市售)内加入医用液体石蜡油20ml，放进一块52孔微量玻璃试验板，使板沉至盒底。(2)用0.25毫升的微量定量加液器分别加入待测血清和阳性对照血清2-3微升/孔，阴性对照用Hanks液代之。加样针尖应磨平。(3)用同法每孔内加入待测的淋巴细胞2～3微升，应先加阴性对照和补体对照孔，然后

8、加待测孔，最后加阳性血清对照孔，加后轻摇使其混匀，置室温作用1小时。(4)每孔加入兔补体5-7微升(按加淋巴细胞顺序加入)，置37℃培育45分钟(或室温作用1小时)。(5)每孔加入2%台盼兰等渗液3-5微升静置室温中20分钟，吸去兰色上清液。(6)普通显微镜检查，记录每孔中死细胞(着色细胞)数。死细胞：体积稍大，着兰