免疫学实验-凝集试验

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1、实验一凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutinationreaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大

2、部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。[目的要求]1.掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2.掌握凝集试验的结果判定及判定标准。3.熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。[材料与试剂]1.玻板，载玻片，试管（1cmx8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。2.灭菌的生理盐水，灭菌

3、的0.5%石炭酸生理盐水。3.布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。4.鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。[实验内容及操作方法]（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1.试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。2.被检血清稀释：第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5ml0.5%石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度

4、吸管吸取被检血清0.2ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5ml弃之，再吸取0.5ml加入第2管中，混匀后吸取0.5ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5ml（见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。3.对照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生理盐水0.5ml，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5ml，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5ml。4.加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5%石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5ml。表1-1布氏杆菌病试管凝集

5、试验术式表（单位：ml）试管号1234567对照管最终血清稀释度1：251：501：1001：200抗原阳性血清阴性血清1：251：250.5%石炭酸生理盐水2.30.50.50.50.5被检血清0.20.50.50.50.50.5抗原(1：20)0.50.50.50.50.50.50.5弃1.5弃0.55.感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24h取出），然后观察并记录结果。6.结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强

6、度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底

7、中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。7.判定标准：能使50%抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。[注意事项]1.实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。2.结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判

8、阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。（二）布氏杆菌病平板凝集试验1.加血清：取洁净玻板一块，用蜡