微生物限度检查法标准操作规程.docx

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1、微生物限度检查法标准操作规程一、目的:建立微生物限度检查的基本操作规程,为微生物检查人员提供正确的操作规程。二、适用范围:适用于品管化验室的微生物限度检查。三、职责:品管微生物检验员对本标准的实施负责。四、正文:1定义:微生物限度检查法:系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法,包括染菌量及控制菌的检查。2实验用具:电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯(365nm波长)。3培养基:3.1营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、乳糖胆盐培养基、蛋白胨水培养基。3.2培养

2、基的管理、配制应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配制规程。4试液:甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。5稀释剂:0.9%无菌氯化钠溶液。6供试品溶液的制备:取供试品(供试品如为固体,置研钵中研磨成细粉)放入试管中,加入适量的稀释剂制成1:10浓度的供试品溶液。7对照用菌液:控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验,对照菌株为大肠杆菌[CMCC(B)441022]。取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内,培养18-20小时,稀释至1:106,对照菌的加入量为50-100个。8检查法:8.1除另有规定外,细菌的培养温度

3、为30-35℃,霉菌的培养温度为25-28℃,控制菌的培养温度为35±1℃。8.2细菌、霉菌计数:8.2.1平皿菌落计数法取均匀供试液,进一步稀释成1:102、1:103等适宜的稀释级。分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中,再注入约45℃的培养基约15ml,混匀,等凝固后,倒置培养,每个稀释级应作2~3个平皿。营养琼脂培养基用于细菌计数,玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。8.2.2菌数测定阴性对照试验取供试验用的稀释剂各1ml,置4个无菌平皿中,分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板,培养,检查,不得长菌。8.2.3细菌培养时间为48小时,分别

4、在24小时及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为准,霉菌培养时间为72小时,分别在48小时及72小时点计菌落数,一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片,不宜计数。8.2.4点计后,计算各稀释级的平均菌落数,按菌数报告规则报告菌数。8.2.5菌数报告规则:细菌宜选取平均菌落数在30-300之间的稀释级,霉菌宜选取平均菌落数在30-100之间的稀释级,作为报告菌数计算的依据。如只有1个稀释级菌落数在30-300(30-100)之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告,如同时有两个稀释级在30-300(30-100)之间时,按下式计算两级比值。比值=低稀释级平均菌

5、落数稀释倍数高稀释级平均菌落数稀释倍数.当比值≤2时,以两稀释级的均值报告,当比值>2时以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告,如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30-300(30-100)之间时,以后两个稀释级计算级间比值,如各稀释级的平均菌落数均不在30-300(30-100)之间,以最接近30或300的稀释级平均菌数乘以稀释倍数报告,如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上,按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告,如各稀释级平均菌落数均小于30时,一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告,如当1:10(1:100)稀释级平均菌落数等于或大于原液(或1:10)时,应以培

6、养基稀释法测定,按测定结果报告菌数。8.2.6培养基稀释法:取供试液(原液或1:10供试液)3份,每份各1ml,分别注入5个平皿内(每皿各0.2ml)每个平皿中倾注营养琼脂培养基约15ml,混匀,凝固后倒置培养,计数,每1ml注入的5个平板点计的菌落数之和即为每1ml的菌落数,共得3组数据,以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。如各稀释级平板均无菌落生长,或仅最低稀释级平均菌落数小于1时,则报告菌数为小于10个。8.3控制菌检查除另有规定外,取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、cm2),直接或处理后接种,经增菌、分离培养后,进行革兰氏染色、生化试验等项检查。

7、8.3.1大肠菌群:8.3.1.1检样稀释及培养①以无菌操作,将检样25g(ml)放于含有225ml灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后,最好在均质器中以8000—10000r/min的速度处理1min,作成1:10的均匀稀释液。②用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖不要接触管内稀释液),混合均匀,做成1:100的稀释液。③另取1ml灭菌吸管,按上述操作顺序,做10倍递增稀释液。如此

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