微生物限度检查法（11051107）标准操作规程.doc

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1、目的：制定微生物限度检查法标准操作规程。范围：适用于微生物限度检查。职责：QC室严格执行本规程，QC人员对相关项目的检验负责。内容：1、依据：《中国药典》2015年版四部（1105、1106、1107）第140、145、149页。2、概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。3、微生物计数法：微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数，计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN）。3.1、计数培养基适用性检

2、查和供试品计数方法适用性检查3.1.1、供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。3.1.1.1、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。菌液制备按表1规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠

3、菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。表1试验

4、菌液的制备和使用试验菌株试验菌液的制备计数培养基适用性检查计数方法适用性试验需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数需氧菌总数计数霉菌和酵母菌总数计数计数金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间18～24h胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。/胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。/铜绿假单胞菌Pseudo

5、monasaeruginosa[CMCC(B)10104]枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis[CMCC(B)63501]白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC(F)98001]沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。沙氏葡萄糖

6、琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。黑曲霉菌Aspergillusniger[CMCC(F)98003]沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养温度20～25℃，培养时间5～7天，或直到获得丰富的孢子3.1.1.2、阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。3.1.1.3、培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时用相

7、应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。3.1.2、计数方法适用性检查3.1.2.1、供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采用适宜的方法制备供试液。制备时若需加温应加热均匀且温度不得超过45℃。供试液从制备到加入检验用培养基不得超过1小时。3.1.2.1.1、水不溶性供试品的制备取供试品，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或PH7.2磷酸盐缓冲溶液，或胰酪大豆胨液

8、体培养基溶解或稀释制成1:10供试液，若需要，调节供试液PH至6-8，必要时用同