赤枝拷（castanopsiskawakamii）叶绿体dna的提纯方法研究

《赤枝拷（castanopsiskawakamii）叶绿体dna的提纯方法研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、Vol.42No.2Mar.2003厦门大学学报(自然科学版)JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)研究简报•文章细号:0438-0479(2003)02-0257-04赤枝榜(Castanopsiskavuakamii)叶绿体DNA的提纯方法研究朱小龙，张宜挥，邹娟，连玉武(厦门大学生命科学学院，福建厦门361005)摘要：建立了一个快速、简便的提取赤枝^{Castanopsiskaxvakamii)叶绿体DNA的方法，该方法主要步鼻包括，叶绿体分离

2、、DNABI处理、裂解.去蛋白和纯化.本方法具有髙产率、高纯度、高质■和快速简便等优点，省去了传统的蔗糖密度梯度离心和氯化佬密度梯度离心等昂贵、耗时的步鼻•对获得的叶绿体DNA进行了限制性内切酵消化、RAPD分析并摸索岀其最适反应条件.关键词：赤枝拷’叶绿体DNA；提取;RAPD中图分类号：Q946取福建三明赤枝拷保护区⑴3个样地中有代表性的赤枝構植株嫩叶样品•探索了赤枝拷cpDNA的提取方法，进行了限制性内切酶分析并建立RAPD分析反应系统，为后继的赤枝拷先锋株系的确定和扩散模式研究等工作奠定

3、了基础，同时本方法可以供壳斗科其他植物cpDNA的提取提供参考.1材料与方法1.1植物材料在福建三明瓦坑赤枝榜林3个样地中取有代表性植株的嫩叶•各植株上采的样品洗净晾干，保存于一76P超低温冰箱中.1.2试剂•所用引物•TagDNA酶，核昔酸(dNTPS)分子，Marker等均为上海生工公司产品；其它试剂均为国产分析纯试剂.试剂配置，1)STEbuffer；400mmol/L蔗糖，50mmol/LTris-HCU20mmol/LEDTA,0・2%BSA,0・2%p-收箱日期：2002-05-09

4、基金項目：福建省自然科学基金(D991005)资助项目作者■介：朱小龙(1977—),男，硕士研究生.文献标识码：AMe；pH3.&2)STbu££er：50mmol/LTris-HClt400mmol/L蔗糖,0.l%BSA,pH7.&•3)NETFbuffer：50mmol/LEDTA,1.25mol/LNaCl*50mmol/LTris-HCL50mmol/LNaF»pH&0.4)BufferD：50mmol/LTris-HCU25mmol/LEDTA,pH&0.5)饱和酚:Tris-HC

5、KpH&0)配，混合2〜3次至pH&0.6)酚：氯仿(25：24).7)氯仿：异戊»(24：1)・8)3mol/LNaAc»pH5.2.9)70%乙醇.10)无水乙醇.11)TE：10mmol/LTris~HClt1mmol/LEDTA,pH&0.12)1.25mol/LNaCl.13)RNase(10mg/mL)：将RNase溶于10mmol/LTris-HCKpH7.5).14)TBE(5000mL)：24gTris-jt，13.75g硼酸,10mmol/LEDTA・15)DNaseI：加

6、ddH^O至浓度为10mg/mL.1.3操作步骤1.3.1叶绿体分离1)叶子洗净.擦干，去中脉•称重50g,49黑暗饥饿处理24h・2)预冷捣碎杯，加200mLSTEbuffer.BSA0.4g.P-Me0.4g,高速匀浆，每次10s,20次，4〜6层纱布过滤.2)09、1000r/min离心20min,去沉淀.3)取上清，09、4000r/min离心20min.4)去上清,STEbuffer30mL重悬沉淀，0°C、4000r/min离心20min回收叶绿体颗粒.1.3.2DNase处理1)往

7、叶绿体顆粒沉淀加2mLSTbuffer重悬.2)将125pgDNasel(10mg/mL)和40pL1mmol/LMgCl2溶于2mLSTbuffer中，加入叶绿体悬浮液，使总体积为5mL,DNaseI终浓度为250Mg/mL.3)37P水浴，20min,不时摇匀.4)加0.5mol/LEDTA3.3mL终止酶解.(终浓度0.2mol/L).5)加250mLNETFbuffer冲洗.0*C、4000r/min离心20min,马上溶解或一20*C保存.1.3.3cpDNA分离提纯1)沉淀加8mLb

8、ufferD、O.4mL20%SDS.2OyLP_Me,60*C、20min,不时摇匀.2)加等体积饱和酚，加10pLp-Me,摇匀10min,12000r/min离心10min.3)上清加酚：氯仿抽提，摇匀5min,12000r/min、离心10min.4〉上清加氯仿：异戊醇抽提，摇匀5min,12000r/min、离心10min.5)上清加1/10体积3mol/LNaAcU倍体积异丙醇，一209过夜.6)4"CJ2000r/min,离心15min.7)弃上清，70%乙醇洗，挥干乙醇.8)加1