微生物实验报告：普通染色和格兰染色

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1、实验二细菌的分离和革兰氏染色一、实验目的1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；3．识别细菌的革兰氏染色结果；4．学习无菌操作技术。二、实验原理一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染

2、色阳性反应。三、实验器材载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。四、实验步骤1、涂片左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。室温下自然干燥。2、固定手持或镊子夹载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回

3、移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。3、初染滴加1滴草酸铵结晶紫染液，染色1分钟，水洗，吸干。4、媒染用碘液冲去残留水，再加1滴碘液覆盖涂片1分钟，水洗，吸干。5、脱色用吸水纸吸去玻片上的残留水，滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片，倒掉脱色液，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。脱色时间20~30秒。6、复染滴加1滴蕃红染液复染1-3分钟以上，水洗。1、显微镜观察吸干载玻片背面及标本周围水渍，先用4*10的倍数找到合适的视野，再油镜观察。一、实验结果6张装片的实验结果见表1，照片见图1。表1.各菌种的染色结果及形态特

4、征菌名形态特征染色结果结论枯草芽孢杆菌个体较大，呈杆状，多见成对短链状红色，G－假阴性金黄色葡萄球菌个体小，球状，成团存在紫色，G＋符合理论大肠杆菌个体小，短棒状，分散存在红色，G－符合理论未知菌个体小，球状，分散存在紫色，G＋未知菌为G＋菌酵母个体巨大，卵状，成团存在紫色，G＋符合理论牙垢个体小，球状，成团存在，杂质较多紫色，G＋牙垢中基本上为G＋菌（a）枯草芽孢杆菌，10×100倍放大（b）金黄色葡萄球菌，10×100倍放大（c）大肠杆菌，10×100倍放大(d)未知菌，10×100倍放大（e）酵母，10×100倍放大（f）牙垢，10×100倍放大图1.微生物革兰氏染色显微照片一、讨论

5、1．涂片时的干燥在涂片时，如果是直接调菌液，则用接种环一蘸即可，如果是从平板菌落上取样，事先滴水时千万不要滴太大的液滴，总之是为了使涂片尽快干燥。如果不慎水加多了，不能用吸水纸吸，因为此时还没有固定，会将大部分细菌吸走。可考虑放到酒精灯上方较远处，微热干燥，以手心能感到温暖为宜。不能太低，会对细菌造成杀伤。2．固定本次实验中较难掌握度的一步。在火焰上方约10cm处来回过3～4次即可。固定不充分的话后续清洗时会将细菌洗掉，固定过热的话又将细菌烧焦，不能上色。需要注意的是，热固定会改变细菌的内部结构和外形，若研究菌体细胞结构时还是要用化学固定法。3．脱色时间最难掌握度的一步！脱色时，最初洗下的

6、酒精都看不出初染的蓝色，也就无法判断脱色是否充分，所以只能通过多次实验，建立洗脱时间梯度来逐步摸索。我们的金黄色葡萄球菌做了3次才得到勉强理想的染色结果。个人觉得用不了书上说的30s，洗2次大约15s就足够了。基础实验，我们可以根据已知的菌种知识来调节洗脱时间，比如G＋就洗短点，G－就洗长点，但是对于以后的未知菌种，这样做是不可以而且不可能的！所以一定要在基础试验中打下扎实的革兰氏染色操作基础，标准化动作，以后才能对未知菌种做出正确鉴定。1．大肠杆菌的复染老师事先提醒过大肠杆菌不好染色，复染可延长时间。我们复染5分钟后镜检，发现染色效果不理想，于是小心地拆下盖玻片不使镜油污染样品，再次滴加

7、蕃红染色5分钟，累计10分钟复染。第二次镜检的结果就好多了。说明我们的补救方法是可行的。另外，我们对面是几位重做实验的同学，助教为他们准备了大肠杆菌平板。一开始我们误将此板当作酵母，根本没考虑二者菌落外形的巨大差异，制片后一致在困惑酵母怎么这么小而且是阴性的（我们居然分不清菌落特征却还记得分清细菌个体），重复制片结果仍然如此！苦恼中求助助教，才发现取错样品了。拿到酵母平板后，惊叹于二者菌落外形差异如此巨大我们却没有注意到